生物化学实验报告
胰蛋白抑制剂
4.30 4.4 0.96 标准曲线相对迁移率1.210.80.60.40.204.2
y = -1.1856x + 6.11852R = 0.9527蛋白分子量对数4.34.44.54.6图2-2
4.74.84.955.1
样品蛋白：
Marker迁移的距离：4.6cm 蛋白质迁移的距离：2.3 cm
绿豆蛋白的相对迁移率（Rm）=2.3/4.6=０.５ 绿豆蛋白的lgMr= 5.5257 绿豆蛋白的Mr= 35691.92
６实验过程及结果分析及感想
由图可见，通过对数分子量及相对迁移率可对照求出未知蛋白分子量。 蓝带跑不到底的原因主要是电泳较长时间后，看见电压过大，以为电阻过高，电泳已跑完或不能再跑而就提前断电取板胶。
由于在第一次实验中，未注意到充分搅拌，以致在电泳时随能进行，但结果是不成完整的直带，胶根本没法用作数据分析，这让我们觉得一天白忙了，但更使我们注意到细节的重要性，为以后的试验铺好道路。
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实验三：细胞色素C的制备和测定
1实验目的：
掌握制备细胞色素C的操作技术和含量测定方法。
通过细胞色素C的制备，了解制备蛋白质制品的一般原理和步骤。
2实验原理：
细胞色素是包括多种能够传送电子的含铁蛋白质总称。它广泛存在于各种动物、植物组织和微生物中。细胞色素是呼吸链中极重要的电子传递体，细胞色素C只是细胞色素的一种。它主要存在于线粒体中，需氧最多的组织如心肌酵母细胞中，细胞色素C含量丰富。
细胞色素C为含铁卟啉的结合蛋白质，分子量约为13000，蛋白质部分由104个左右氨基酸残基组成。它溶于水，在酸性溶液中溶解度更大，故可自酸性水中提取，制品可分为氧化性和还原性两种，前者水溶液呈深红色，后者水溶液呈桃红色。细胞色素C对热、酸和碱都比较稳定，但三氯乙酸和乙酸可使之变性引起某些失活。
本实验以新鲜猪心为材料，经过酸溶液提取，人造沸石吸附，硫酸铵溶液洗脱和三氯乙酸沉淀等步骤制备细胞色素C，并测定其含量。
3材料设备及试剂
3.1.材料：
猪心
3.2.试剂：
2mol/L H2SO4溶液，1mol/L NH4OH（氨水）溶液，0.2%NaCl溶液，25%(NH4)2SO4溶液，BaCl2试剂，20%三氯乙酸（TCA）溶液，人造沸石（Na2O·Al2O3·xSiO2·yH2O):白色颗粒，不溶于水，选用60-80目，联亚硫酸钠（Na2S2O4·2H2O)。
3.3.器材：
电磁搅拌器，电动搅拌器，GL-20B型 高速冷冻离心机，721型分光光度计，玻璃柱（2.5×30cm），500mL下口瓶，烧杯（2000mL，1000mL，500mL，400mL，200mL各一个),量筒，移液管，玻璃漏斗，玻璃棒，透析纸，纱布。
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4.试验步骤：
4.1总流程
猪心处理 提取 中和调PH 沸石再生 过柱吸附 取50ml备用 洗脱 盐析 TCA沉淀 透析 测定标准曲线 含量测定
图3-1
4.2具体步骤
【材料处理】
将已搅碎的冷冻猪心解冻，除去脂肪、软骨、血管、韧带，放入塑料容器中备用。
【沸石再生】
将人造沸石用蒸馏水清洗，至洗液澄清，而且沸石无氨气味、pH=7。 【提取】
相容器中加入250ml蒸馏水电动搅拌器搅拌2h，边搅拌边加入2mol/L H２SO
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溶液，调pH至4.0(此时溶液呈暗紫色）。
【中和调PH】
用1mol/LNH4OH调pH至6.0，停止搅拌，用数层纱布挤压过滤，收集滤液。
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用1mol/LNH4OH调pH至7.2，静臵沉淀分层后，用纱布过滤，得红色滤液。 【过柱吸附】
裁剪一块圆形滤纸，安装在玻璃柱底部，柱架垂直，下端连接乳胶管并用夹子夹好，向柱内加入蒸馏水至１/４体积，装入已经再生好的沸石，待沉淀充分，打开夹子，使柱内沸石面上留一薄层水，将红色滤液从下口瓶中注入柱内，使之沿柱壁流下，控制流速约２－３ml/min，人造沸石由白变粉红，流出液为淡黄为红色，停止吸附。 【洗脱】
向柱内注入自来水，洗至水清，注入蒸馏水，洗至水清，用100ml0.2%NaCl溶液分3次洗涤沸石，注入蒸馏水洗至水清。 【盐析】
用25%硫酸铵溶液洗脱，流速控制在2ml/min以下，收集红色洗脱液。 【ＴＣＡ沉淀】
边搅拌边加入20%TCA，沉淀析出，将沉淀以3000rpm/min的转速离心15min，倾去上清液，收集细胞色素C沉淀，加少许蒸馏水，搅拌溶解，离心30min-60min，收集上清液并记录体积。 【透析】
将上清液注入透析袋，放进500ml烧杯中，对蒸馏水透析，15min换一次水，用BaCl２溶液检查SO４2—是否被除净，透析液与BaCl２反应无沉淀，将透析液过滤，清亮的细胞色素C粗提品溶液。 【含量测定】
取1ml样品，稀释相应适当倍数，配臵成3ml溶液，加少许联二亚硫酸钠，震荡，在波长520nm处测吸光度值。
５实验数据及其处理
【标准曲线测定值】
表3-1
标准溶液体积/ml OD值
0.1 0.039 0.2 0.086 0.4 0.184 0.6 0.264 0.8 0.346 1.0 0.449 【测定值】
表3-2
过沸石 未过沸石 提取液体积/ml 1.4 0.5 水/ml 1.6 2.5 联二亚硫酸钠/ml 0.4 0.4 OD值 0.080 0.105 14
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【标准曲线】
细胞色素C含量测定标准曲线y = 0.4429x2R = 0.99890.4490.40.30.20.10000.0390.0860.40.6图3-2
0.5OD0.3460.2640.1840.20.811.2标准溶液体积/ml
注：细胞色素Ｃ曲线基本参数：
M=13000
m=0.0025g
n=1.92×10-7mol
V=7.5ml
c=2.56×10-5mol/L
【数据处理结果】
表3-3
过沸石 未过沸石 提取液体积/ml 1.4 0.5 标准样体积 水/ml 1.6 2.5 联二亚硫酸钠/ml 0.4 0.4 物质的量 OD值 0.08 0.105 标准样体积 0.1806 0.2371 试样浓度 过沸石 未过沸石 0.1806 0.2371 原液总体积 4.62×10-6mol 6.07×10-6mol 3.3×10-3mol/L 1.21×10-2mol/L 过沸石 未过沸石
3mL 1.5mL 粗品总量 9.9×10-6mol 1.8×10-5mol 粗品总质量 0.129g 0.234g ６实验过程及结果分析及感想
６.１产量比理论值低
过沸石的，产量是理论值的一半，未过沸石的，产量也是仅仅９０％多，总
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