生物化学实验报告
结原因如下：
在原料处理时，由于血管、脂肪、软骨等东西没有除尽，导致原料中并不纯为猪心。
在实验中，取滤液时并为全部吸出、取沉淀时并未倒尽滤液等操作误差，和由于一些我们自身的试验技巧不足导致的手误，导致样品并不纯。
由于在过柱时，沸石颗粒本身比较小，猪心滤液残渣含量比较高，致使柱子堵塞，基本不下流，所以把沸石倒入一较大的容器，把滤液也倒入，固定时间搅拌，促进吸附。
7 思考题
1.为做好本实验应注意哪些关键环节？为什么？
答：⑴力争除尽猪心非心肌组织，避免吸附时堵塞；⑵提取中和注意调pH，掌握流速，令细胞色素C可被充分提取；⑶盐析时固体硫酸铵要边加边搅拌，量一定要算准加至45%，少则不足，多则盐溶；⑷沸石再生要彻底，细胞色素C提取才能完全；⑸透析袋不漏。
2．试以细胞色素C的制备为例，总结出蛋白质制备的步骤。
答：蛋白质制备一般步骤：⑴材料处理（加pr特定染料）⑵提取⑶吸附⑷洗脱⑸盐析⑹沉淀⑺透析⑻测定。
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实验四：溶菌酶的提取和系列性质测定
1实验目的
? 掌握溶菌酶的提取方法
? 了解溶菌酶提取的基本原理、掌握其基本操作 ? 掌握测定酶活力和蛋白浓度测定的一般原理及方法 ? 熟悉酶测活的步骤
? 学会根据实验事实，判断脲抑制的类型
? 掌握测定酶Km值的方法及测定和判断抑制剂类型 ? 掌握酶的最适pH值的测定方法及基本步骤 ? 掌握测定酶的最适温度的方法及基本步骤 ? 掌握SDS-PAGE测酶分子量的方法及基本步骤 ? 掌握SDS-PAGE测酶制剂纯度的方法及基本步骤
2实验原理
Ⅰ 溶菌酶的提取
在研究酶的性质、作用和反应动力学等问题时都需要使用高度纯化的酶制剂以避免干扰。酶的提纯工作往往要求多种分离方法相交替应用，才能得到较为满意的结果。常用的分离提纯方法有：盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、离子交换层析、凝胶过滤和亲和层析等。酶蛋白在分离提纯过程中易变性失活。为获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终注意保持酶的活性，如在温和环境下操作等。
溶菌酶（Ec.3.2.1.17），又称胞壁质酶、N-乙酰胞壁质聚糖水解酶、球蛋白G，是一种具有抗菌作用的粘多糖酶。溶菌酶分子量约为14.4kD是一种强碱性蛋白，等电点在10.0以上，并对温度和酸不敏感。在自然界中，溶菌酶普遍存在于鸟类和家禽的蛋清中，哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿液和淋巴液等的细胞中。植物中卷心菜、胡萝卜和木瓜等也含有。以蛋清中含量最丰富，鸡蛋中约含有0.3%。
Ⅱ 酶活力、蛋白质浓度测定
棕红色的染料考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后，形成蓝色复合物，最大吸光度由465nm变为595nm，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白和染料的结合符合比尔定律（Beer’s Law），通过测定595nm处光吸收值的增量可对蛋白质浓度进行
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测定。
溶菌酶是一种N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，该酶可以催化水解细菌细胞壁N-乙酰胞壁酸和N-乙酰胺基葡萄糖之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性多糖分解为可溶性糖肽，使细菌溶解。本实验以溶壁微球菌（M.Lysodeikticus）为底物，通过测定细菌悬浊液浊度的变化（OD600）来测定溶菌酶的活性。
Ⅲ 酶促动力学（Km测定、脲的抑制）
酶促动力学研究酶促反应的速度及影响速度的各种因素，而米氏常数Km值等于酶促反应速度为最大速度的一半时所对应的底物浓度，其数值大小与酶的浓度无关，是酶促反应的特性常数。不同酶的Km不同，同一种酶在与不同的底物反应时，其Km值也不同。Km反映了酶和底物亲和能力的强弱程度。大多数纯酶的Km在0.01-100mmol/L之间。酶的活力可以被某些物质激活或抑制，凡能降低酶的活性甚至是酶失活的物质，称为酶的抑制剂，酶的活力抑制有可逆抑制和不可逆抑制两种。而可逆的抑制又包括有竞争性抑制，非竞争性抑制等类型，在有抑制剂存在条件下，酶的一些动力学性质发生改变，如Km，Vmax等。通过实验的方法，可以确定出抑制类型
图4-1
Ⅳ 酶的最适pH
一般地说酶是蛋白质，具有许多可解离的极性基团，在不同的酸碱环境中，这些基团的解离状态不同，所带电荷不同，而它的解离状态对保持酶的结构，底物与酶的结合能力以及催化能力都有重要作用。同时许多底物或辅酶也具有解离
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特性，pH的变化也影响它们的解离状态，同样影响酶活力，因此溶液的pH对酶活性影响很大。若其它条件不变，酶只有在一定的pH范围内才能表现催化活性且在某一pH时，酶的催化活性最大，此pH称为酶的最适pH。各种酶的最适pH不同。但多数在中性，弱酸性或弱碱性范围内，如植物和微生物所含的酶，其最适pH多在4.5-6.5；动物体内酶最适pH多在6.5-8.0，当然也有例外。本实验在不同的pH缓冲液中测定酶活力，可得出此条件下的最适pH。
Ⅴ 酶的最适温度
化学反应速度一般都受温度影响，反应速度随温度的升高而加快，但在酶促反应中，随着温度的升高，蛋白质的变性速度也在加快，从而使反应速度减慢直至使酶完全失活。因此在酶催化的反应中，升高温度既可以使反应速度加快，同时又会引起酶的失活而降低反应的速度，只有在某一温度时，酶促反应的速度最大，此时的温度称为酶作用最适温度。需要注意，体外实验时，酶作用的最适温度不是一个恒定不变的常数，而是与反应时间有关，这说明酶的最适温度只是在一定条件下才有意义。
Ⅵ SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测酶分子量及纯度测定
SDS-PAGE是在要走电泳的样品中加入含有SDS和β-巯基乙醇的样品处理液，SDS即十二烷基磺酸钠，是一种阴离子表面活性剂即去污剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构，强还原剂β-巯基乙醇可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键，破坏蛋白质的四级结构。电泳样品加入样品处理液之后，要在沸水中煮3-5min，使SDS与蛋白质充分结合，以使蛋白质完全变形和解聚，并形成棒状结构。SDS与蛋白质结合后使蛋白质-SDS复合物上带有大量的负电荷，平均每两个氨基酸残基结合一个SD分子，这是各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖。这样就消除了各种蛋白质本身电荷上的差异。样品处理液中通常还加入溴酚蓝染料，用于控制电泳过程。另外样品处理液中也可加入适量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加样时样品溶液可以沉入样品槽底部。
制备凝胶时首先要根据带分离样品的情况选择适当的分离胶浓度，例如通常食用的15%的聚丙烯酰胺凝胶的分离范围是104-105，即分子量小于104的蛋白质可以不受孔径的阻碍而通过凝胶，而分子量大于105的蛋白质则难以通过凝胶孔径，这两种情况的蛋白质都不能得到分离。所以如果要分离较大的蛋白质，需要食用低浓度如10%或7.5%的凝胶（孔径较大）；而对于分离较小的蛋白质，使用较高浓度凝胶可以得到更好的分离效果。分离胶聚合后，通常在上面加上一层浓缩胶（约1cm），并在浓缩胶插入样品梳，形成上样凹槽。浓缩胶是低浓度的聚
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丙烯酰胺凝胶，由于浓缩胶具有较大的孔径（丙烯酰胺浓度通常还为3-5%），各种蛋白质都可以不受凝胶孔径阻碍而自由通过。浓缩胶通常还PH较低（通常还PH=6.8)，用于样品进入分离胶前将样品浓缩成很窄的区带。浓缩胶聚合后取出样品梳，上样后即可通电开始电泳。
样品在电泳过程中首先通过浓缩胶，在进入分离胶前由于等速电泳现象而被浓缩。这是由于在电泳缓冲液中主要存在三种阴离子，Cl?、甘氨酸阴离子以及蛋白质—SDS复合物，在浓缩胶的PH值下，甘氨酸只有少量的电离，所以其电泳迁移率最小，而Cl?的电泳迁移率最大。在电池的作用下，Cl?最初的迁移速度最快，这样在Cl?后面形成低离子浓度区域，即低电导区，而低电导区会产生较高的电场强度，因此Cl?后面的离子在较高的电场强度作用下会加速移动。达到稳定状态后，Cl?和甘氨酸之间形成稳定移动的界面。而蛋白质—SDS复合物由于相对量较少，聚集在甘氨酸和Cl?的界面附近而被浓缩成很窄的区带（可被浓缩三百倍），所以在浓缩胶中Cl?是快离子（前导离子），甘氨酸是慢离子（尾随离子）。
当甘氨酸到达分离胶后，由于分离胶的PH值（通常PH=8.8）较大，甘氨酸离解度加大，电泳迁移速度变大超过蛋白质—SDS复合物，甘氨酸和Cl?的界面很快超过蛋白质—SDS复合物。这时候蛋白质—SDS复合物在分离胶中以本身的电泳迁移速度进行电泳，向正极移动。由于蛋白质—SDS复合物在单位长度上带有相等的电荷，所以它们以相等的迁移速度从浓缩胶进入分离胶。进入分离胶后，由于聚丙烯酰胺的分子筛作用，小分子的蛋白质可以容易地通过凝胶孔径，阻力小，迁移速度快；大分子蛋白质则受到交大的阻力而被滞后，这样蛋白质在电泳过程中就会根据其各自分子量的大小而被分离。
溴酚蓝指示剂是一个较小的分子，可以自由通过凝胶孔径，所以它显示着电泳的前沿位臵。当指示剂到达凝胶底部时，停止电泳，从平板中取出凝胶。在适当的染色液中染色几个小时，而后过夜脱色。脱色液去除凝胶中未与蛋白结合的背底染料，这时就可以清晰地观察到凝胶中被染色的蛋白质区带。通常凝胶制备需要1-1.5小时，电泳在25-30mA下通常需要3小时，染色2-3小时，过夜脱色。
SDS—PAGE还可以用于未知蛋白质分子量的测定。在同一凝胶上对一系列已知分子量的标准蛋白及未知蛋白进行电泳，测定各标准蛋白的电泳距离，并对各自分子量的对数作图，即得到标准曲线。测定未知蛋白质的电泳距离，通过标准曲线就可以求出未知蛋白质的分子量。
SDS—PAGE还常用于提纯过程中纯度的检测。纯化的蛋白质通常还在SDS点用上应只有一条，但如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带。SDS—PAGE具有较高的灵敏度，一般只需要不到微克量级的蛋白质，而且通过电泳还可以同时得到关于分子量的情况，这些信息
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