生物化学实验报告
对于了解未知蛋白及设计提纯过程都是非常重要的。
3材料设备及试剂
3.1.材料：
新鲜鸡蛋四个；Amberlite-CG-50阳离子交换树脂
3.2.试剂：
磷酸氢二钠（Na2HPO4）；磷酸二氢钠（NaH2PO4）； 氯化钠（NaCl）；硫酸铵（(NH4)2SO4）； 氢氧化钠（NaOH）；甘油；盐酸（HCl）；
0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0；0.5mol/L NaOH；
0.5mol/L HCl；含50%甘油的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0
测活缓冲液（含 30 mmol/L NaCl 的 0.lmol/L 磷酸盐缓冲液， pH 6.2）； 底物溶液（40 mg M .lySodeikticus 干粉溶于 100 mL 测活缓冲液中）； 考马斯亮蓝 G-250试剂（考马斯亮蓝 G-250 100mg 溶于 50 mL 95 ％乙醇中，加入 100 mL 85 ％磷酸，用蒸馏水稀释至 I000 mL ，滤纸过滤。或考马斯亮蓝 G-250 100 mg 溶于 50 mL 95 ％乙醇中，加入 100 mL 85 ％磷酸混匀，配成原液。临用前取原液 15 mL 加蒸馏水稀释至 100 mL ，滤纸过滤）； 标准蛋白质溶液：用 0.1 mol/L NaCl 的 0.1mol/L 磷酸盐缓冲液， pH 7.0 （缓冲液 A ）配制 1mg/ml 牛血清蛋白溶液。 10 mol/L 脲（用测活缓冲液配制）
0.1mol/L 磷酸氢二钠和柠檬酸缓冲液 pH 4.0-8.0 ；0.1mol/ L 甘氨酸和氢氧化钠缓冲液 pH 9.0-10.0
丙烯酰胺（Acr）凝胶贮液【22.2 克Acr，0.6克甲叉双丙烯酰胺（Bis），加水溶解并定容到100ml，过滤后使用】； 10%SDS溶液； 10%过硫酸铵溶液； TEMED溶液；
分离胶缓冲液，1.5MpH8.8的Tris—HCl缓冲液【将18.15克Tris用水溶解后，用6N的盐酸调至pH8.8，定容到100ml】；
浓缩胶缓冲液【0.5MpH6.8的Tris—HCl缓冲液，将6克Tris溶解后，用6N盐酸调至pH6.8，定容到100ml】；
电极缓冲液【将3克Tris，14.4克甘氨酸和1克SDS，加水溶解后定容到1000ml，pH应为8.3】；
样品缓冲液【将1克SDS，2mlβ-巯基乙醇，5ml甘油，1ml试剂⑹和1.0ml0.1%
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溴酚蓝，用水溶解并稀释到50ml】； 0.1%溴酚蓝溶液； 已知分子量的标准蛋白； 未知分子量的蛋白质样品；
考马斯亮蓝溶液【称取0.25克考马斯亮蓝R-250，加入45ml乙醇，10ml冰乙酸和45ml水过滤后使用】；
脱色液【37.5ml冰乙酸，25ml乙醇加水到500ml】； 蛋白溶解液； 上样缓冲液；
标准蛋白液（Marker）【用0.15mol/L NaCl配制1mg/mL牛血清白蛋白溶液】
3.3.器材：
透析袋；层析柱（2.6×30cm）；高速冷冻离心机 分光光度计 恒温水浴锅
垂直板电泳槽；双稳电泳仪
4实验步骤
4.1试验流程图
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样品准备 树脂再生及 前期准备 阳离子交换层析 硫酸铵沉淀 分子筛层析 透析浓缩 酶活力测定 蛋白含量测定 Km 测定 脲的抑制作用 酶最适pH 酶最适温度 分子量及纯度
图4-2
4.2具体步骤
【样品准备】
取新鲜鸡蛋4个，破壳取出蛋清，加入1.5倍体积的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0，搅拌均匀，并始终调pH7.0，然后用八层纱布过滤，留取上清液，量取体积并记录，留0.5mL上清液（定为步骤Ⅰ样品）-20℃冻存备用。
【树脂再生及前期准备】
把准备好的Amberlite-CG-50阳离子交换树脂用0.5mol/LNaOH浸泡30min，
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水洗至中性，再用0.5mol/L HCl浸泡30min，水洗至中性。
在烧杯中将再生好的阳离子交换树脂用0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0平衡。
【阳离子交换层析】
1. 吸附：在已平衡好的阳离子交换树脂中加入蛋清样品，并用玻璃棒搅拌
吸附1h以上。
2. 洗涤：留0.5mL上清液（定为Ⅰ’步骤样品）-20℃冻存备用。倒去其
余上清液，树脂用100mL0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0洗涤三遍。 3. 装柱：将数值搅拌均匀装入2.6×30cm层析柱，再用350mL含0.05mol/L
NaCl的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0洗涤杂蛋白。
4. 洗脱：用300mL含0.5mol/L NaCl 的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0
以3mL/min的流速进行洗脱，合并光吸收高峰管，量取体积并记录，留0.5mL上清液（定为Ⅱ步骤样品）。
【硫酸铵沉淀】
每100mL上清液中缓缓加入35g硫酸铵固体，溶解后静臵1h以上，以10，000rpm〃min-1离心15min，沉淀用0.5mL左右含0.1mol/L NaCl的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0溶解0.5-1h。再用同一转速离心几分钟，留取0.05mL上清液（定为Ⅲ步骤样品）-20℃冻存备用。
【分子筛层析】
将溶解的硫酸铵沉淀样品以10，000 rpm?min-1离心3min，上Sephacyl S-100 HR柱、洗脱。流速控制在15mL/h，分部收集洗脱峰，2mL/管。合并光吸收及酶活高峰管。
【透析浓缩】
用含有50%甘油的蒸馏水，pH7.0透析浓缩4h，-20℃分装冻存（定为Ⅳ步骤样品）备用。
【蛋白含量测定】
标准曲线的制定：取14支试管，按下表分两组进行平行操作。
表4-1
管号 0 1 2 3 4 5 6 标准蛋白溶液mL 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水mL 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 考马斯亮蓝３mL G-250 摇匀，４０min以0号试管为空白对照，在595nm处比色 A595
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表4-2
标准溶液体积/ml OD值 0.1 0.154 0.2 0.237 0.4 0.523 0.6 0.699 0.8 0.823 1.0 0.911 绘制标准曲线：
以A595为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。
OD值1.210.80.60.40.200
测定未知样品蛋白质浓度：
标准曲线y = 0.8737x + 0.10640.8230.6990.5230.1540.2370.20.40.6图4-3
0.9110.81标准溶液体积1.2取未知样品测A595值，用标准曲线求其含量和浓度。
表4-3
编号 0 1 2 3 4 5 未知蛋白含量mL 0 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 蒸馏水mL 1.0 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 考马斯亮蓝G-250 ３mL 摇匀，４０min以0号试管为空白对照，在595nm处比色 A595
【酶活力测定】
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