基因工程（跨课程）综合性实验
水基团能够保证阳离子脂质体分散在水介质中时形成脂双层结构，从而有效的保护分子中的疏水部分，并将氨基端的基团暴露于水介质中。氨基对于转染能力是绝对必要的，因为它能够通过静电引力与DNA结合并将DNA大分子压缩成可运输的小单元，即形成脂质体复合物。使DNA 分子处于紧缩状态，阳离子脂质体起了中间桥梁的作用，使生物膜表面对DNA 质粒复合物的排斥力降低，有利于DNA分子透过生物膜，提高目的基因的感染率。有很多物理因素如：粒子大小、Zeta电位、DNA/脂质体比例和介质离子强度等都影响脂质复合物的稳定性，复合物的形成和转染效率。
3、质粒pCDNA3.1-TCRVβ7.1 3.1 质粒pCDNA3.1
质粒pCDNA3.1为真核表达载体，具有表达克隆化 cDNA所需的启动子、增强子、加poly(A) 信号等调控元件，及SV40病毒复制子、G418筛选标记基因等序列，是一个高效真核表达载体，为了便于基因操作，多克隆位点有正反两套酶切位点，本实 验采用的是 pCDNA3.1(一)载体。 质粒pCDNA3.1载体的图谱如下：
3.2 T 细胞表面受体(TCR)
肿瘤特异性细胞毒性T细胞(CTL)为肿瘤免疫治疗提供了基础。肿瘤抗原依赖性的T细胞免疫应答通过T细胞表面的抗原受体( TCRs) 与抗原提呈细胞
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(APCs)表面的抗原肽-MHC 复合物相互作用而启动。
T 细胞对抗原肽-MHC 复合物识别是由TCR 的立体结构完成的。TCR 是存在于T 细胞表面的多肽链复合物，分为恒定区(C) 和可变区(V )。人类外周血95%T 细胞表达α/βTCR， 3%～ 5%T 细胞表达γ/δTCR 。近年来发现TCR 中存在ευδ链。α/β的V 区与抗原识别有关，γδευδ链可能与抗原结合和信号传递有关。编码α链的基因由约80 个V 区基因片断、80 个连接区(J ) 片断和一个C 区片断组成; 编码β链的基因由约60 个V 区、2 个D 区(Cβ1,Cβ2)、2 个C 区和13 个J 区(Jβ1. 1～ 1. 6, Jβ2. 1～ 2. 7) 片断组成。以上基因片断在T 细胞发育过程中重排, 产生为数极多的TCR, 以适应不同的T 细胞识别不同的特异性抗原。
特异性抗原刺激T细胞扩增的过程中，T细胞受体β链可变区上的互补决定区(CDR)对抗原识别和T细胞活化发挥着重要的作用。TCR Vβ选择性的T细胞扩增后将释放各类细胞因子抑制肿瘤细胞扩增。
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实验一 质粒pCDNA3.1-TCRVβ7.1的大规模制备
一、实验目的
了解质粒大规模制备基本流程；掌握碱裂解法提取质粒DNA和层析技术纯化质粒DNA的原理与方法；熟悉琼脂糖电泳、紫外吸收等DNA检测与鉴定技术。
二、实验原理
质粒大规模制备在非病毒类载体的重组DNA药物研究开发与生产中占据核心地位。含目的基因的大肠杆菌质粒的提取纯化工艺主要建立于常规碱法制备和柱层析分离纯化手段。对于基因治疗和基因疫苗用临床级质粒DNA的制备而言，去除宿主细胞来源的蛋白、基因组DNA、RNA和内毒素等大分子杂质是主要任务。
在常规碱法制备中，在EDTA存在的条件下，经NaOH和阴离子去污剂SDS处理，使细胞膜崩解，从而达到菌体充分的裂解。此时，细菌染色体DNA缠绕附着在细胞膜碎片上，离心时易被沉淀出来。而质粒DNA则留在上清液内，用有机溶剂沉淀，可获得质粒DNA。
经过碱裂解制备的质粒DNA，还含有大量杂蛋白、内毒素及部分基因组DNA、RNA，在工业规模制备时，一般采用柱层析方法进行分离纯化。离子交换层析纯化质粒主要利用了各种大分子物质的荷电差异。在适当的pH条件下，质粒DNA与大部分杂蛋白都带负电荷，前者所带负电荷一般多于后者，并且质粒DNA电荷数目与基因组DNA、RNA等也存在一定的差异，因此，可利用该性质，通过离子交换层析将其分开。
作为基因治疗或疫苗用途的临床级质粒，还须对质粒的不同构象进行分离，以获得理想的超螺旋质粒DNA，方法以离子交换、分子筛、疏水层析等柱层析方法为主（此处略）。 三、实验试剂
1、 LB培养基：配制每升培养基，应在950ml去离子水中加入：
胰化蛋白胨 10g 酵母提取物 5g
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NaCl 10g
摇动容器直溶质溶解。用5M NaOH 调pH值至7.0。用去离子水定容止1L。在15psi高压蒸汽灭菌20min[临用前按1:1000倍体积加入卡拉霉素溶液(10mg/ml)]。
2、 卡拉霉素储液：浓度60mg/ml，双蒸水溶解，保存于－20℃；
RNA酶：浓度10mg/ml，保存于－20℃。
3、 碱裂解溶液Ⅰ（高压灭菌）：50mmol/L 葡萄糖、 25mmol/L Tris－Cl（pH8.0）、
10mmol/L EDTA （pH8.0）。
4、 碱裂解溶液Ⅱ：0.2M NaOH、 1％（m/V）SDS（高压灭菌）。 5、 碱裂解溶液Ⅲ（高压灭菌）：5mol/L 乙酸钾 60.0ml 冰乙酸 11.5ml H2O 28.5ml
6、 TE（Tris EDTA）：10mmol/L Tris-Cl (pH 8.0)、1mmol/L EDTA (pH 8.0)。 7、 0.02M NaCl的TE溶液。 8、 0.3M NaCl的TE溶液。 9、 1.0M NaCl的TE溶液。 10、 11、
0.5M NaOH。
50×TAE：每1升溶液包含：242g Tris碱、57.1ml 冰乙酸、100ml 0.5mol/L
EDTA （pH 8.0）。 12、 13、
10×上样缓冲液。
STE（高压灭菌）：10mmol/L Tris－Cl（pH 8.0）、0.1mol/L NaCl、1mmol/L
EDTA (pH 8.0)。
四、实验用具
离心管、移液器、电热恒温水浴、电热恒温培养箱、恒温振荡器、高速冷冻离心机、常压层析系统、超净台、电泳仪、水平电泳装置、紫外检测仪。
五、实验方法
（一）培养细菌使质粒扩增
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1、2ml菌种接种于200ml LB培养基[临用前按1:1000倍体积加入卡拉霉素溶液(10mg/ml)]中，37℃，220rpm，培养3h。 （二）减法大量提取质粒DNA
1、 培养菌液，5000g，4℃，离心2min，弃去上清培养液。
2、 将细胞沉淀重悬于5ml STE中，4℃，5000g，离心2min，去掉洗涤液，使细胞沉淀尽可能干燥。
3、 加入5ml冰预冷的溶液Ⅰ，重悬沉淀。
4、 向离心管中加入10ml新鲜配制的溶液Ⅱ，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。应确保离心管的整个内表面均与溶液Ⅱ接触。不要振荡，将离心管静置5min。
6、 后向离心管中加7.5ml冰预冷的溶液Ⅲ，温和地振荡10秒钟使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将离心管置冰上5min。 7、 4℃，12000g，离心15min，取上清。
8、 加0.6倍体积的异丙醇，4℃放置15min。常温12000g，离心20min，弃上清。 9、 加70％乙醇，12000g离心10min，弃上清，沉淀在空气中干燥。 （三）离子柱层析纯化并鉴定质粒DNA
1、以8mlTE（含20μg/ml的RNase A）溶解沉淀，37℃，保温2 hr后留取1ml用于纯度鉴定，再将余液以TE稀释至50ml；以30ml 0.02M NaCl的TE溶液平衡DEAE层析柱，上样。
3、 用0.02M NaCl的TE溶液洗柱至基线平衡，后改用0.3M NaCl的TE溶液洗柱至基线平衡（去处杂蛋白及其它小分子物质），后改用0.5M NaCl洗柱至基线平衡（洗脱质粒DNA），在洗脱过程中收集各吸收峰。 4、 0.8％琼脂糖电泳检测各洗脱峰，确定质粒所在洗脱峰。 5、 测定所得质粒260、280吸收值，计算浓度和纯度。
六、注意事项
1、实验菌种生长的好坏直接影响质粒DNA的提取，因此对存放时间较长的菌种需要事先加以活化。有关细菌培养、保存的方法请查阅微生物有关书籍。 2、细菌培养过程要求无菌操作。抗菌素等不能高温灭菌，应使用细菌滤器过滤
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