基因工程（跨课程）综合性实验
LB培养基的制备：分别配制1%细菌培养用蛋白胨，0.5%酵母抽提物和1%氯化钠，混匀后加蒸馏水定容至相应的体积并进行灭菌。 说明：
1）由于安装等问题，如果发酵设备不能到位，则参考去年发酵实验方案进行摇瓶实验（讲义另行提供）。
2）利用实验机动时间，进行发酵设备讲解。
每组 8～9人 由代教老师介绍发酵装置和附件（空压机、蒸汽发生器），主要是管路连接、设备原理和主要操作。每组1h。如果其他实验安排后，仍有较多等待时间，也可以扩大设备讲解时的实验分组到16～17人。
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基因工程（跨课程）综合性实验
实验八 表达产物分离纯化
一、实验目的
熟悉大肠杆菌系统包涵体形式表达产物分离纯化工艺流程及包涵体蛋白变性与复性的原理、条件与操作步骤。
二、表达产物分离纯化工艺流程
建立高效和质量可控的目的产物分离纯化工艺是基因工程制药的最主要技术瓶颈之一。大肠杆菌系统表达产物分离纯化的主要任务是高效获取高比活性的表达产物，去除宿主蛋白质、核酸、内毒素等主要杂质类型。当外源基因胞内高效表达时，由于宿主细胞内的微环境不利于表达产物的折叠，表达产物正确折叠的速度跟不上产物形成的速度，而使得表达产物主要以不溶的、无序折叠的包涵体形式存在，因此，还必须建立高效的包涵体蛋白变性与复性工艺，且这一工艺过程又是分离纯化工艺的主要技术屏障。
基于包涵体表达形式的表达产物分离纯化工艺流程为：
工程菌菌体 破菌 包涵体制备与纯化 变性（裂解） 复性（重折叠） 2-3步柱层析分离纯化 纯品（原液）
三、表达产物分离纯化原理 （一）包涵体蛋白的变性与复性 1、包涵体制备与纯化：
工业上可采用超声波法或高压匀浆法破碎大肠杆菌工程菌。由于包涵体是水不溶性颗粒，其密度（比重）高于所有细胞器，所以可采用差速离心法从工程菌细胞裂解物中制备包涵体。
包涵体是由表达产物、膜脂蛋白、DNA、RNA、脂类和多糖等众多大分子物质组成的复杂混合物，对水不溶的包涵体进行适当的洗涤可去除包涵体表面的
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各种杂质，对表达产物进行初步纯化。一般常采用表面活性剂(如Triton X100)或/和低浓度尿素等去除难于处理的膜脂蛋白类杂质，以适当提高包涵体蛋白中目的产物的含量，便于进一步分离纯化。 2、包涵体蛋白的溶解（裂解、变性）
利用高浓度的变性剂如8M尿素或7M GuCl破坏包涵体蛋白质中的氢键，以还原性巯基试剂（如DTT、β-ME）破坏分子间和分子内的二硫键，使蛋白质的多肽链处于完全的自由伸展状态。 3、蛋白质复性
采用适当的方法去除变性剂，使表达产物由自由伸展状态转变为正确折叠状态，以恢复蛋白质天然构象和活性的过程称为复性。在理论上，蛋白质的空间结构信息已包含于多肽链的一级结构中，因此，在体外只要给予适当条件，任何处于自由伸展状态的多肽链都有形成正确折叠的可能。
蛋白质折叠的具体步骤可用下式描述：
U→I→N ↓ A
即伸展态U经过早期变化成为中间体I，然后由中间体过渡到最后的天然态N。但是从中间体折叠为天然态的同时，另有一条旁路，即中间体相互聚集为凝聚物A(包含体)。在折叠反应中，从伸展态到中间体的形成是非常快速的，一般在毫秒范围内完成，但从中间体转变为天然态的过程比较缓慢，是反应的限速步骤。当溶液中离子强度或变性剂浓度很低，又无其它辅助手段存在时，聚集趋势占主导地位，导致蛋白质的自发复性效率极低。因此，在蛋白质复性的时候，主要是促进中间体向天然态的转变。一般认为，蛋白质在复性过程中，涉及两种疏水相互作用，一是分子内的疏水相互作用，二是部分折叠的肽链分子间的疏水相互作用。前者促使蛋白质正确折叠，后者导致蛋白质聚集而无活性，两者互相竞争，影响蛋白质复性收率。因此，在复性过程中，抑制肽链间的疏水相互作用以防止聚集，是提高复性收率的关键。在实际操作中，采用较低的蛋白浓度、缓慢降低变性剂浓度、以化学或物理方法减少分子间的碰撞机会是减少分子间聚沉的常用方法，而稀释复性和柱层析复性则是工业上最常用的复性工艺。
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对于含二硫键的蛋白质而言，二硫键的形成在多肽链的重折叠（蛋白质复性）中起决定性作用，二硫键的形成速度和半胱氨酸残基间配对的正确性决定了复性的速度和复性产物空间结构的正确性。包涵体蛋白变性后，所有半胱氨酸的巯基（-SH）处于还原状态，在蛋白的复性过程中，组成二硫键的二个半胱氨酸残基间的巯基氧化形成共价的二硫键。当天然的蛋白质或多肽存在多对二硫键时，变性蛋白折叠过程中二硫键的形成位点至关重要。在理论上二硫键的形成信息由蛋白质的一级结构信息决定，因此只要复性条件恰当，蛋白质复性过程中分子内或分子间能形成正确的二硫键。为了促进巯基的氧化和二硫键的形成，一般在复性体系中采用还原型谷胱甘肽（-SH）-氧化型谷胱甘肽（S-S）或半胱氨酸（-SH）-胱氨酸（S-S）组成的氧化还原体系。
（二）表达产物分离纯化
目的产物的分离纯化策略多种多样，复性与分离纯化可分开操作或结合在一起进行，可先复性再分离纯化、先纯化变性蛋白再复性或复性与纯化同时进行。1、先复性再纯化：
包涵体形式表达的产物经复性后再采用各种色谱柱技术进行进一步的分离纯化。由疏水层析、离子交换层析和分子筛层析是最常用的制备型色谱技术，一般采用2-3步柱层析即可获得纯度超过95%的表达产物，且在此过程可有效去除宿主核酸、内毒素和非正确折叠得异构体。如果采用的是融合表达方式，则利用Tag的抗体或受体设计亲和层析也是实验室常用纯化方法，但此类方法由于存在成本高，亲和介质寿命短和配基污染等问题，不太适用于工业化生产。 2、先纯化变性蛋白再复性
即在高浓度变性剂存在条件下，先通过各种色谱柱层析技术获得纯的、变性蛋白，然后以纯的变性蛋白进行稀释复性，再以柱层析去除非正确折叠的产物。 3、复性与纯化同时进行
以各种柱层析方法复性，并在复性过程中进行纯化。
四、实验材料及试剂
1、试剂：发酵菌体、Tris、HCl、EDTA、尿素、Triton X-100、二硫苏糖醇
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（DTT）、谷胱甘肽(还原型)、谷胱甘肽(氧化型)
2、菌体裂解液：20mM Tris-HCl pH8.0、1mM EDTA
3、包涵体洗涤缓冲液I：20mM Tris-HCl pH8.0、1mM EDTA、2M尿素 4、包涵体洗涤缓冲液II： 20mM Tris-HCl pH8.0、1mM EDTA、1% Triton
X-100
5、包涵体洗涤缓冲液III： 20mM Tris-HCl pH8.0、1mM EDTA、20mM NaCl 6、包涵体裂解缓冲液： 20mM Tris-HCl pH8.0、8M尿素 7、包涵体复性缓冲液： 20mM Tris-HCl pH8.0+ 谷胱甘肽系统
五、实验仪器与用具
冷冻离心机、天平、磁力搅拌器、超声波仪、 50ml烧杯、玻璃棒、滴头吸管、50ml离心管、EP管
六、实验步骤
1、发酵菌液，4℃，5000rpm，离心5min（同时取100ul菌液4℃保存，作为1号样品）。
2、弃上清，收集菌体沉淀，称菌体湿重，以菌体裂解液按30%（W/V）的稀释度悬浮菌体。
3、在冰浴条件下，将超声探头没入悬浮液内进行超声波破碎。超声破碎条件视超声仪功率而定，当采用300W功率超声仪时，每次处理的菌体悬浮液以30ml 为宜，一般总超声15min，超声3秒停2秒。
4、4℃，10000rpm，离心10min，弃去上清（用无菌牙签挑取大约牙签粗头大小的沉淀，编号，溶于40ul1×SDS上样缓冲液中备用）。
5、沉淀按5%（W/V）的稀释度悬浮于包涵体洗涤缓冲液I，充分混匀。4℃，10000rpm，离心10min，弃去上清。
6、沉淀按5%（W/V）的稀释度悬浮于包涵体洗涤缓冲液II，充分混匀。4℃，10000rpm，离心10min，弃去上清。
7、沉淀按5%（W/V）的稀释度悬浮于包涵体洗涤缓冲液III，充分混匀。4℃，10000rpm，离心10min，弃去上清。重复洗涤3次。最后所得的沉淀即为包涵体
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