基因工程（跨课程）综合性实验
规模制备 3 4 质粒-脂质体复合物制备 T淋巴细胞体外转染 转染T细胞5 目的基因表达检测 转染T细胞6 体外活性检测 转染T细胞7 体内给药试验 实验总结暨
试验技能知识竞赛 4 10 10 4 6 8 脂糖电泳鉴定、DNA纯度测定。 以脂质体包被纯化所获重组质粒，以紫外吸收法测定包封率。 以质粒-脂质体复合物转染T细胞 以流式细胞仪分析转染T细胞中目的基因的表达情况（学生制备样品、老师操作流式细胞仪）。 以转染的T细胞攻击肝癌细胞，以流式细胞仪分析杀瘤活性（学生制备样品、老师操作流式细胞仪）。 荷瘤鼠建模、目的基因体内转染与表达分析（部分内容示教）。 对综合实验性实验进行总结，讲解实验报告要求，并据情况组织相关知识竞赛。
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基因工程（跨课程）综合性实验
二、实验日程
（日期：07/6/4——07/6/22；作息时间：9:00-21:30）
04（1）班 04（2）班 （先做重组蛋白质药物单元） （先做重组DNA药物单元） Am：综合实验公开课（课室：B2-314，8:30准时开始） Pm：单元讨论、IL-18工程菌构建、 IL-18菌种活化接种和平板划线接种 工程菌表达筛选（温控表达诱导） 工程菌生长曲线分析 工程菌表达筛选SDS－PAGE （凝胶保存备用），选定菌株，接种 Pm：单元讨论、TCR工程菌构建、 TCR菌种活化接种 质粒DNA大规模制备：碱法裂解、中和、异丙醇沉淀、洗盐 质粒DNA大规模制备：层析纯化、电泳鉴定、紫外吸收法测定质粒纯品纯度和浓度 班级 日程 第1天 4日/6月 星期一 第2天 5日/6月 星期二 第3天 6日/6月 星期三 第4天 7日/6月 星期四 第5天 8日/6月 星期五 第6天 9日/6月 星期六 工程菌甘油种制备 质粒-脂质体复合物制备、包封率测表达影响因素试验（诱导时机的影响） 定、T细胞体外基因转染 表达进程试验接种（GST菌种） 表达影响因素试验SDS-PAGE （胶保存备用） 表达进程试验（IPTG诱导、不同时间点取样） 准备 转染T细胞体外活性检测之一： 肿瘤细胞接种，培养 转染T细胞目的基因表达检测：T细胞-肿瘤细胞共培养、流式样品制备和检测 转染T细胞体外活性检测之二：流式细胞仪分析细胞凋亡 第7天 准备 10日/6月 星期日 第8天 表达进程分析SDS-PAGE（胶保存备用） 转染T细胞体内给药实验 11日/6月 试验结果讨论与分析、看病理与免疫星期一 组化照片 第9天 SDS-PAGE凝胶扫描分析（三次电泳胶） 准备 12日/6月 发酵罐观摩（418室） 星期二 第10天 表达产物产物的分离纯化（示教） 13日/6月 试验结果分析与讨论 星期三 重组DNA药物单元开始， TCR菌种接种 第11天 质粒DNA大规模制备：碱法裂解、中14日/6月 和、异丙醇沉淀、洗盐 星期四 第12天
准备 工程菌表达筛选（温控表达诱导）（前一天下午IL-18接试管与平板划线） 工程菌生长曲线分析 工程菌表达筛选SDS－PAGE 质粒DNA大规模制备：离子交换层7
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15日/6月 析纯化、电泳鉴定、紫外吸收法测定质星期五 粒纯品纯度和浓度 第13天 准备 16日/6月 星期六 第14天 下午接种（每组派1个代表） 17日/6月 星期日 （凝胶保存备用），选定菌株。 准备 下午接种（每组派1个代表） 第15天 质粒-脂质体复合物制备、包封率测定、工程菌甘油种制备 18日/6月 T细胞体外基因转染 表达影响因素试验（诱导时机的影星期一 响） 表达进程试验接种（GST菌种） 第16天 转染T细胞体外活性检测：肿瘤细胞接19日/6月 种，培养 星期二 第17天 转染T细胞体外活性检测：T细胞与肿20日/6月 瘤细胞共培养 星期三 第18天 转染T细胞体外活性检测与目的基因表21日/6月 达检测：流式细胞仪分析 星期四 第19天 转染T细胞体内给药实验 22日/6月 试验结果讨论与分析 星期五 表达影响因素试验SDS-PAGE （胶保存备用） 表达进程试验（IPTG诱导、不同时间点取样） 表达进程分析SDS-PAGE（胶保存备用） SDS-PAGE凝胶扫描分析（三次电泳胶） 发酵罐观摩（418室） 表达产物产物的分离纯化（示教） 试验结果分析与讨论 备注：
1）带有阴影字体所述实验的菌株为GST菌株（Tac启动子，IPTG诱导）。 2）综合实验公开课安排（第一天，6月4，星期一）
8：30～9：00 黄院长讲话（开设实验的背景、对学生的要求） 9：00～10：30 全体实验教师亮相，然后由李黄金做综合实验整体介绍 10：30～10：40 休息十分钟
10：50～12：00 就实验安排和内容等提问和答疑（双向） （请安排有经验学生摄影)
13：30 分班按所进行的实验单元进行工程菌构建回顾与讨论（以实验室分班和小组为单位）
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三、实验分组
1 、分组
每个班按学号顺序分为8组，组号按序依次为1－8组，每组人数分别为9、9、9、8、8、8、8、8。涉及到排序的实验项目，如在超净工作台上的接种步骤，一律按1到8组顺序进行。
2 、编号
实验过程中必需对试管、摇瓶等进行标记，故统一进行编号。 编号规则为：班代表字母+组号-成员号，A代表1班，B代表2班。 举例：
04（1）班1组1号同学挑取的转化子标记为A1-1； 04（1）班8组8号同学挑取的转化子标记为A8-8； 04（2）班1组1号同学挑取的转化子标记为B1-1；
04（2）班8组8号同学挑取的转化子标记为B8-8； 其余以此类推。
3 、实验安排
生物制药04（1）班先进行“重组蛋白质药物”单元的实验，然后进行“重组DNA药物”单元的实验。生物制药04（2）班先进行“重组DNA药物”单元的实验，然后进行“重组蛋白质药物”单元的实验。具体教室见实验中心的通知。
4、 注意事项
由于综合实验内容比较多，希望各位同学精诚合作，特别是分光光度计、离心机等仪器的使用，由于数量有限，请发扬团队精神，尽量按顺序或同步进行以节约时间。
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四、实验要求与质量控制
综合实验涉及的知识点和实验技术众多，为了培养学生严谨求实、科学求真之精神，并达到综合实验之最大成效，以下对本综合实验过程的要求进行说明，且纳入实验考核成绩。
1、预习
实验前须充分预习，要求随机抽查时，每一位同学能够清晰的阐述整体实验思路和具体的实验项目、原理。
2、实验过程
除了遵守学校与学院一般实验纪律与要求外，还必须做到主动性、能动性与团队精神相接合，利用有限的资源与时间得到最好的培训与实验结果。为此，本综合实验将能否在规定时间内完成实验内容作为衡量学生动手能力的关键指标之一，并作为考核结果记入实验成绩中。要达到此目的，同学们必须提前仔细阅读实验讲义，全面了解实验内容，透彻理解实验原理，熟悉各个操作步骤，并在实验过程中合理安排时间。
3、实验原始记录与结果整理
每天必须及时、真实、完整地记录当天所做实验情况，记录实验过程中的异常情况，分析其原因，并将下述关键性实验结果整理于实验报告纸： I 重组蛋白质药物单元：
1）表达筛选与甘油种制备：随机挑选转化子表达诱导SDS-PAGE凝胶扫描照片、筛选确定的工程菌株株号及其表达水平（%）。
2）生长曲线分析：选定工程菌培养过程中的OD600测定结果表及生长曲线图。 3）表达影响因素试验：不同诱导时机表达诱导实验诱导前、后样品的SDS-PAGE凝胶扫描照片、表达水平、OD600值。
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