基因工程（跨课程）综合性实验
4）表达进程试验：工程菌（GST）表达诱导过程不同时间点样品SDS-PAGE凝胶扫描照片、表达水平。
5）表达产物分离纯化：示教分析与讨论 II 重组DNA药物单元：
3）质粒DNA大规模制备：阴离子交换纯化层析图、提取和纯化过程中样品琼脂糖电泳图、质粒纯品纯度和浓度测定结果。 3）质粒-脂质体复合物制备：包封率测定结果
3）基因转染、体外表达、体外活性、体内给药：示教分析与讨论
4、综合实验报告
须按《基因工程（跨课程）综合实验论文撰写规范》撰写、并提交综合实验报告（电子打印版及电子版）。 1）封面：
标题： 基因工程（跨课程）综合性实验论文 姓名： 班级： 学号：
指导教师：李黄金、周林、胡海梅、赵林、陈伟、段涛、张玲、袁茵
薄华本、王金全、吴凤麟
广东药学院
生命科学与生物制药学院 生物制药研究所 2)知识产权申明
本综合性实验所采用的工程菌株与工艺技术参数主要来源于广东药学院生物制药研究所的相关课题与研究成果，相关知识产权归广东药学院生物制药研究所所有，未经许可不得擅自影印相关讲义和使用相关工程菌株与工艺技术参数。 3)论文内容 中英文摘要 英文摘要 前言 材料与方法 结果与讨论 参考文献
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致谢
五、重组蛋白质类药物
重组蛋白质类药物统称基因工程药物，该类药物通用名常冠以“重组…”前缀，因采用基因工程或重组DNA技术手段生产而得名。该类药物在化学和生物学本质上属于人源或其它动植物和微生物来源的、具有高度生物学活性的蛋白质或多肽，它们在自然界的含量极微，传统的天然提取工艺常难以达到工业规模和质控要求，而基因工程则为此类活性物质的工业规模高效生产提供了手段。利用基因工程手段生产的最终目的是在一个合适的系统中，使外源基因高效表达，从而生产有重要价值的蛋白质产品。广义的基因工程包括外源基因的克隆、表达载体和表达系统的构建、表达生产（发酵）和分离纯化等过程。外源基因表达系统有原核表达系统和真核表达系统两大类。目前用于基因工程药物生产的原核表达系统主要是大肠杆菌系统，真核表达系统主要有毕赤酵母（Pichia pastoris）系统和哺乳动物细胞CHO系统。
大肠杆菌系统因具有操作简单、表达水平高、生产成本低等优点而在基因工程制药中具有不可替代的地位。本综合实验以hIL-18的大肠杆菌表达系统为例，全面介绍和学习工程菌构建、表达筛选、甘油种制备、生长与表达分析、发酵工艺单元操作和表达产物分离纯等基因工程药物研发与生产实践中最常用的技术与工艺过程。
（一）、背景知识
1、工程菌及工程菌构建
工程菌在基因工程产业中是特指经基因工程手段构建的、用于生产的菌种。工程菌构建包括目的基因的获得、表达载体的构建、转化、转化子表达筛选、传代稳定性分析、鉴定和种子库建立等内容。
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2、 基因工程药物工艺与质控
基因工程药物工艺研究包括工程菌构建与分析、发酵工艺（上游工艺）研究、分离纯化工艺（下游工艺）研究和制剂工艺研究等内容，质控研究则贯穿于工程菌构建和上、下游工艺研究的全过程，并以工程菌菌种库、半成品原液和成品为主要质控点。
图2 基因工程制药最常见工艺流程
生产菌种 菌种活化 种子液制备 发酵 离心收菌 粗提 精纯 除菌 原液 稀释、配制 冷冻干燥 成品
3、 目的基因在大肠杆菌中的表达形式
根据表达产物使用目的的不同和操作方法的差异，目的基因（外源基因）在大肠杆菌内可以以不同形式进行表达。根据表达产物定位可分为胞内表达和分泌表达二种基本形式；根据表达产物多肽链的N端或C端有无其它氨基酸序列可分为融合表达和非融合蛋白等二种基本类型；另外，在胞内表达方式下，根据表达产物的可溶与否，还可分为包涵体方式表达和可溶方式表达。在大多数情况下，非融合蛋白和融合蛋白的胞内高效表达（非分泌表达）产物常以不溶的包涵体形式存在。
非融合表达：指目的蛋白的N端和C端均不带有目的蛋白以外的氨基酸残基。为了表达非融合蛋白，使用的外源基因必须具有从起始密码子到终止密码子的完整读码框架。非融合蛋白的一级结构和天然蛋白质相同，是一些体内应用基因工程产品的必要条件，但是小分子非融合蛋白在原核细胞内不稳定，易被降解，而且不易纯化。
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融合表达：即在目的蛋白的N端或C端带有其它的氨基酸序列。为了表达N端融合蛋白，一般在表达载体的SD序列之后加上起始密码子，其后为一段原核读码框架，接着是克隆位点。外源基因经处理后克隆到该位点，其读码框架必须和上游的原核读码框架符合。表达C端融合蛋白的载体，在SD序列之后为克隆位点，其后是一段带有终止密码子的原核读码框架，将只有起始密码子而没有终止密码子的外源基因插入到克隆位点，必须保持外源基因的读码框架和载体上原核读码框架相符合。融合蛋白在大肠杆菌细胞内较稳定，不易被细胞内的蛋白酶降解。作为融合蛋白一部分的原核多肽往往可以利用来纯化、检测该融合蛋白，这种多肽又称作“标签”（Tag）或受体蛋白，目前最常用的标签有His6和GST。
分泌表达：所谓原核细胞的“分泌型表达”是指在细菌胞浆内合成的多肽进入内膜和外膜的周间质，而不是指合成的多肽分泌到细胞外。将一段原核或真核细胞的信号肽序列连接到欲表达基因的上游，在表达的蛋白进入细胞周间质时，信号肽被信号肽切割酶系统（各类蛋白酶）水解，产生游离的表达产物。分泌型表达可以保护外源蛋白不被细胞内的蛋白酶降解，增加表达产物的稳定性。由于表达的蛋白可以在周间隙进行折叠，具有天然蛋白的构象，所以分泌型表达的蛋白一般具有生物活性。分泌型表达的缺点是表达量较低，有时会产生信号肽不完全切割的融合蛋白，有时会发生非特异性切割，应慎使用。
4、原核表达载体的基本组成元件
启动子：启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列，它是基因表达的“发动机”，是基因表达最关键的调控元件。由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核表达载体所应用的启动子必须是原核启动子。将外源基因克隆在其下游，原核RNA聚合酶识别该启动子后，带动真核基因在原核细胞中转录。原核表达系统中常采用可调控的强启动子，基于乳糖操纵子调控模型的启动子是最常用的启动子，包括Lac(乳糖启动子)、LacUV5（突变型乳糖启动子，不受葡萄糖阻遏）、Tac（乳糖和色氨酸的杂合启动子）和T7启动子(来自T7噬菌体的强启动子和RNA聚合酶组合)等，它们可由乳糖诱导，在实践中主要采用不易被降解的乳糖类似物IPTG作诱导剂。λPL和PR（λ噬菌体的左右启动子）是另一类较常用的强启动子，其诱导模式主要基于其阻遏蛋白
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的温敏型突变子，即高温（42℃）失活，启动目的基因转录。
SD序列：在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3-10bp处的由3-9bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA的3’末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点，即为SD序列。SD序列与AUG的距离将显著地影响基因的表达水平。 转录终止子：构建表达载体时，为了防止目的基因表达时转录过头和干扰载体的稳定性，一般都在多克隆位点的下游插入一段很强的转录终止序列或采取双终止子串联。
复制起点：载体自我增殖所必不可少的基本条件，并可协助维持使每个细胞含有一定拷贝数的质粒。在一般情况下，一个质粒只含有一个复制起点。
标记基因：表达载体通常采用的标记基因是抗生素抗性基因，有利于重组表达载体转化子的筛选，常用的抗生素筛选标记基因为氨苄青霉素和卡那霉素抗性基因。
5、人白介素18（hIL-18）
hIL-18又称IFN-γ诱生因子，由活化的巨噬细胞产生，主要生物学活性是诱导Th1细胞产生IFN-γ，诱导T细胞产生GM-CSF，促进T细胞和NK细胞增殖分化、促进Fas配体表达，抑制新血管形成，因此，在感染性疾病、恶性肿瘤和免疫性疾病方面具有较大的潜在应用价值。成熟的hIL-18是由157个氨基酸残基组成的多肽，分子量约为18KD，不含信号肽和糖基化位点，内含4个半胱氨酸残基，但并不形成二硫键。
本实验单元即以hIL-18为重组蛋白质药物代表。
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