基因工程（跨课程）综合性实验
实验二 工程菌表达筛选
一、实验目的
学习与掌握大肠杆菌系统工程菌表达筛选的方法。
二、实验原理
含目的基因的表达载体转化宿主细胞后，会得到很多含有重组子的克隆，但这些含有重组子的不同克隆表达目的蛋白的能力是不相同的。首先诱导不同克隆进行目的基因表达，然后利用SDS－PAGE对菌体总蛋白进行分离，再通过凝胶扫描分析各克隆的目的产物表达水平差异即可筛选到高表达菌株。
三、实验试剂
1、pBV220-hIL-18转化平板
2、LB培养基：胰化蛋白胨 10g、酵母提取物 5g、NaCl 10g，定容至1L，用5M NaOH调PH值至7.0。15psi（1.05Kg/cm2）高压蒸汽灭菌20min。 3、琼脂粉
4、氨苄青霉素：储存液浓度50mg/ml，用水溶，保存于－20℃。工作浓度：松弛型质粒50ug/ml，严紧型质粒20ug/ml。
5、2×SDS上样缓冲液：0.1mol/LTris（pH6.8）、4％SDS、20％甘油、0. 2％溴酚篮、200mmol/L DTT（或10％β－巯基乙醇），4℃保存。 6、10％APS，TEMED和DTT存放在4℃冰箱。
7、10×电泳缓冲液：Tris 6g、glycine 28.8g、SDS 10g，pH调至8.3，定容至1L。 8、30％胶母液（Acr－Bis）：30％acrylamide、0.8％bis（即acrylamide 30g、bis 0.8g 定容至100ml），可在4℃存放数月。 9、分离胶缓冲液（pH8.8）：1.5M Trsi－HCl。 10、
浓缩胶缓冲液（pH6.8）：1.0M Trsi－HCl。
11、10％SDS
12、考马斯亮篮染色液：1.25g考马斯亮篮R250、450ml甲醇、50ml冰醋酸、500ml水。
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13、脱色液：450ml甲醇、50ml冰醋酸、500ml水。 14、10%（V/V）甘油
四、实验用具
无菌竹签、微量移液器、平皿、10-15ml带螺口或带塞试管、恒温摇床、4℃冰箱、离心机、EP管、电炉、电泳仪、垂直电泳装置、台式脱色摇床、凝胶成像系统。
五、实验方法
（一）目的蛋白的诱导表达
1、转化（已完成）：转化后的细胞在含有50ug/ml氨苄青霉素的LB平板上，培养过夜后，在平板上会长出许多抗性菌落（转化子）。 2、菌种活化和平板划线接种
在无菌操作条件下，用无菌竹签随机挑取中等大小菌落的克隆，先在含有50ug/ml氨苄青霉素的LB平板上轻轻划线接种，线长约为1cm，随后用带有残余菌体的牙签接种含有2ml LB培养基（含50ug/ml氨苄青霉素）的带盖螺口试管，如此类推。
每个学生接种1株，共接种8个转化子单克隆，每个小组共用一个平板；及时、准确做好划线平板与试管的对应编号和平板编号标记。平板和试管种分别置于37℃培养箱和摇床培养过夜。
3、把培养过夜的画线平板保存于4℃冰箱。
4、取2步骤所得支试管的菌液（20ul）按1：100的接种比例分别接种到8支含有2ml LB培养基（含50ug/ml氨苄青霉素）的试管中， 37℃培养2.5hr，42℃诱导培养4hr。每个小组设一非诱导对照，即以该组编号排首位的过夜活化菌种接种一支试管，标记为CK1，37℃培养2.5hr收菌，不做42℃表达诱导。 5、离心收菌
表达诱导至4hr后，将试管收集、并置于4℃保存备用。
（二）工程菌表达筛选SDS－PAGE
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1、样品组成：
每小组共用一胶，每胶10孔，1号孔为非诱导菌体蛋白（对照CK1），2-9号孔为自小至大编号的菌株诱导菌体蛋白，10号孔为蛋白质分子量标准（MM）。 2、菌体样品处理
取培养物100ul于EP管，5000g×5min离心，弃上清，菌体加入40ul上样缓冲液，100℃水浴3min，待冷却后10000g×10min离心，小心吸取上清，转入另一标记好的EP管，室温保存备用（如长期放置，则置于4℃保存，电泳前再煮沸2分钟）。 3、SDS-PAGE
参照附件所述详细方法进行。
胶浓度：分离胶浓度12%；浓缩胶5%； 上样量：15 ul
恒流: 浓缩20mA，分离30mA； 染色、脱色：甲醇/冰醋酸系统
凝胶保存：10%甘油，室温，至凝胶扫描分析。
（三）凝胶扫描分析
参照附件所述详细方法进行。
六、注意事项
1、转化后的大肠杆菌必须在含有适当抗生素的LB平板上进行培养，接种到试管中的菌落必需是单菌落，并且要同时进行划线培养。 2、进行划线培养时各条线之间不能太密集，防止交叉污染。
3、样品加上上样缓冲液煮沸后，一定要进行离心，以除去颗粒物质。 4、电泳上样时要小心，不要污染旁边的泳道。
七、评议
1、过夜培养所得菌体按1：100接入到新的培养基中后，37℃培养2.5hr一般能达到OD600＝0.6，此时即为对数中期。但是各菌株间生长速度常有较大差异，
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所以菌体密度常不相同，但以相同时间和条件培养、诱导能基本反映出菌株生长速度和表达水平差异，因此，各试管（菌株）之间的培养时间一定要相同。 2、电泳中出现不规则的蛋白迁移带是因为电泳不稳定，其它原因还包括样品加量太多、样品中的盐浓度太高、边缘效应。如果在凝胶边缘电泳条带出现“微笑”状的样品（运动速度减慢），可能是因为凝胶的中间比两侧更热，应降低电流。
八、思考题
1、单克隆接种到试管中培养时，为什么同时进行划线培养？
2、SDS－PAGE中蛋白质样品上样前，加入上样缓冲液的目的是什么？为什么还要在100℃沸水中，加热3-5min？
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实验三 工程菌甘油种的制备
一、 实验目的
将高表达的工程菌制备成可中、长期保藏的菌种，掌握甘油种的制备方法。
二、 实验原理
菌种保存是工程菌研究和生产应用的基础，为了避免长期传代可能引起的菌种变异，应建立适合长期保藏的工程菌菌种并进行保藏。菌种保藏的方法主要有固体斜面法、甘油冻存法、冷冻干燥法。本实验采用甘油种结合超低温（-70℃）保存的方法，即用无菌甘油悬浮工程菌，并使甘油终浓度为30%（V/V），所获物即为工程菌的甘油种。低温可使工程菌的生命活动处于非活跃状态而能较长时间保存细胞活力、减少基因变异，而30%的甘油可保护菌种的细胞膜系统在冷冻与解冻循环中不被破坏而起到保护作用。
三、 实验试剂和实验用具
1. pBV220-hIL-18转化子划线平板 2. 抗性LB液体培养基 3. 抗性LB平皿
4. 60％甘油 121℃，30分钟高温灭菌
5. 菌种保存管（EP管） 121℃，30分钟高温灭菌 6. 10ml螺口试管 121℃，30分钟高温灭菌 7. 恒温培养箱 8. 恒温振荡器 9. 无菌工作台 10. 灭菌牙签与酒精灯
四、 实验方法
1. 在实验二中所获平板上确定高效表达的转化子所对应的菌株，并用灭菌
竹签接种于一个含2ml抗性LB培养基的试管中。
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