基因工程（跨课程）综合性实验
2. 37℃振荡培养过夜（10-15小时）。
3. 按1：1（V/V）的比例加入无菌的60％甘油，混匀后分装至事先灭菌
的菌种保存管（1ml/管），-70℃保存。
五、 实验注意事项
此过程全部在无菌工作台中操作，注意操作保持始终无菌。
26
基因工程（跨课程）综合性实验
实验四 工程菌生长曲线分析
一、实验目的
学习用比浊法测定工程菌的生长曲线并了解其特点，掌握工程菌生长曲线的绘制方法及测定原理，理解生长曲线在研究和生产中的应用。 二、实验原理
将工程菌按一定比例接种到一定体积的、适合的新鲜培养基中，在适宜的条
件下进行培养，定时测定培养液中的菌体量，以菌体量的对数作纵坐标，生长时间作横坐标，绘制的曲线叫生长曲线。它反映了单细胞微生物在一定环境条件下于液体培养时所表现出的群体生长规律。依据其生长速率的不同，一般可把生长曲线分为延缓期、对数期、稳定期和衰亡期。这四个时期的长短因菌种的遗传性、接种量和培养条件的不同而有所改变。因此通过测定微生物的生长曲线，可了解各菌的生长规律，对于科研和生产都具有重要的指导意义。
测定微生物的数量有多种不同的方法，可根据要求和实验室条件选用。本实验采用比浊法测定，由于细菌悬液的浓度与光密度（OD值）成正比，因此可利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度，并将所测的OD值与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线，此法快捷、简便。 三、实验材料 3.1菌种 IL-18工程菌 3.2培养基 LB培养基（Amp+） 3.3试剂 去离子水 四、实验仪器与器具
可见光分光光度计（配1cm光程的比色杯），恒温摇床，超净工作台，移液器，Tip头，EP管，玻璃试管，500mL的三角瓶，擦镜纸。 五、实验步骤与方法
实验流程为：种子液→接种→培养→测定
27
基因工程（跨课程）综合性实验
5.1种子液制备
取IL-18工程菌的甘油菌种1管，按1%的接种量在超净工作台取20uL，接入2mL LB(Amp+)中，然后倾斜地置于摇床中，37℃，170rpm摇床培养过夜。 5.2接种培养并取样
按1%的接种量，在超净工作台将过夜培养的2mL IL-18工程菌种子液，接入到200mL LB(Amp+)中，摇匀后取出3mL置于EP管中，用于测0小时的OD值。
将摇瓶放在摇床中，37℃，170rpm振摇培养。此时开始计时，然后每培养1小时将三角瓶取出置于超净工作台中，取样测定其OD值，共测定8小时。其中，前3小时每次取样3mL，之后每次取样1mL。 5.3生物量测定
开启可见光分光光度计电源，调节波长至600nm，将光标移至T处，打开样品室的盖子，预热30min。取3mL未接种的LB(Amp+)培养基装入1cm光程的比色杯中，置于样品室中第一个样品槽中，使可见光射入此比色杯中，作为空白对照，仪器将自动调零。将待测样品加入比色杯中（前3个样品由于OD值低可直接加入，后续的样品由于OD值高需用2mL LB稀释后再加入。），盖上盖子，将光标调至A处，空白样品的OD值自动调整为0。拉动拉杆，依次对样品读数，并记录。 5.4生长曲线绘制
将测定的OD值填入下表： 时间 OD 0h 1h 2h 3h 4h 5h 6h 7h 8h 以上述表格中的时间为横坐标，OD600值为纵坐标，绘制IL-18工程菌的生长曲线。 六、实验注意事项
用可见光分光光度计测量菌液OD600值时，该值在0.30～0.80以内时，OD600与菌液浓度成正比，超过此范围，就不成正比了。对浓度大的菌悬液用未接种的LB液体培养基适当稀释后测定，经稀释后测得的OD值要乘以稀释倍数，才是培养液实际的OD值。
28
基因工程（跨课程）综合性实验
七、评议
在本实验中，通过从同一培养物中每隔一小时取相同量的样来测其OD600，从而绘制生长曲线。也可用相同的菌种，同时培养若干瓶菌液，每一小时取出一瓶停止培养来测其OD600值，下一小时再取出一瓶，一直到培养的最后一小时只剩下一瓶，通过此方法可以避免取样对微生物生长培养造成的影响。 八、思考题
1．用本实验方法测定微生物生长曲线，有何优点？
2．若同时用平板计数法测定，所绘出的生长曲线与用比浊法测定绘出的生长曲线有何差异？为什么？
29
基因工程（跨课程）综合性实验
实验五 工程菌表达影响因素实验
一、实验目的
了解和掌握诱导时机对工程菌表达的影响，进一步理解工程菌生长和表达的矛盾关系，通过实验确定出IL-18工程菌最佳的诱导时机。 二、实验原理
基因工程菌的培养一般分两段。前期是菌体生长，生长到某一阶段，加入诱导因子，诱发产物表达。加入诱导因子的时间被称为诱导时机。对于基因工程菌一般选择其对数生长期作为菌体的诱导时机。如果在对数生长早期进行诱导，由于菌体量较少，蛋白的表达量不高。在对数生长中期进行诱导，工程菌的生长速度比较快，这时蛋白的积累加快，蛋白表达水平较高。而菌体进入对数期后期，由于发酵液中营养的消耗，氧气的缺乏及代谢产物的积累，使菌体的生长速度明显受到抑制。在此状态下诱导，表达显然受到影响。 三、实验试剂 3.1菌种 IL-18工程菌 3.2培养基 LB培养基（Amp+） 3.3试剂 去离子水 四、实验仪器与器具
恒温摇床，超净工作台，移液器，台式高速离心机，Tip头，EP管，玻璃试管，100mL的三角瓶，SDS-PAGE电泳设备。 五、实验步骤与方法 5.1种子液制备
取IL-18工程菌的甘油菌种1管，按1%的接种量分别接入3管2mL LB(Amp+)液体培养基中，然后倾斜地置于摇床中，37℃，170rpm摇床培养过夜。 5.2接种培养并诱导表达
按1%的接种量，将3管过夜培养的IL-18工程菌种子液，分别接入到30mL
30