基因工程（跨课程）综合性实验
LB(Amp+)中，同时置于摇床中37℃，170rpm振摇培养。培养至2.5h时，取出一瓶，在超净工作台中取出3mL测其生物量，然后做好标记，转移至42℃进行诱导表达。当培养至4h时，再取出一瓶，同样地取出3mL测生物量、标记、转移至42℃诱导表达。当培养至6h时，取出最后一瓶，如前取样、标记、诱导表达。三瓶菌体均诱导表达4h。 5.3诱导表达结束菌体处理
三瓶菌体经过4h诱导表达后，从摇床中取出，掏匀后吸取1mL用于测定生物量，另取1mL置于-20℃冻存。 5.4 SDS-PAGE检测不同诱导时机的表达量
将-20℃冻存的菌体解冻后，取出100uL，10000rpm离心3min，弃掉上清，用40uL 2×上样缓冲液悬浮起来，按实验一和附录一进行SDS-PAGE电泳。 六、思考题
根据结果中的OD值和SDS-PAGE电泳的结果，分析工程菌生长和表达的关系。
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基因工程（跨课程）综合性实验
实验六 工程菌表达进程分析（GST）
一、实验目的
通过研究GST工程菌蛋白表达随时间的变化关系，了解和掌握诱导时间对菌体表达量的影响，确定GST工程菌的最佳诱导时间。 二、实验原理
诱导时间是指加入诱导剂后的培养时间。随着诱导时间的延长，外源蛋白的表达量增加，但外源蛋白在细胞内的积累，对重组菌产生毒性，合成速率下降，甚至产物被分解。理论上足够长时间里，菌体的表达随时间呈“S”曲线型。 三、实验试剂 三、实验试剂 3.1菌种 GST工程菌 3.2培养基
LB培养基（Amp+） 3.3试剂
去离子水、0.2g/mL IPTG 四、实验仪器与器具
恒温摇床，超净工作台，移液器，台式高速离心机，Tip头，EP管，玻璃试管，100mL的三角瓶，SDS-PAGE电泳设备。 五、实验步骤与方法 5.1种子液制备
取GST工程菌的甘油菌种1管，按1%的接种量分别接入1管2mL LB(Amp+)液体培养基中，然后倾斜地置于摇床中，37℃，170rpm摇床培养过夜。 5.2接种培养
按1%的接种量，将过夜培养的GST工程菌种子液，接入到200mL LB(Amp+)中，置于摇床中37℃，170rpm振摇培养。 5.3诱导表达并取样进行表达进程分析
培养至4h时，加入50uL 0.2g/mL的IPTG，摇匀后取出1mL菌液用于检测。
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基因工程（跨课程）综合性实验
之后继续培养进行诱导表达。此后每1小时取出1mL用于检测表达量。所取的样品置于-20℃冻存。
5.4 SDS-PAGE检测不同诱导时间的表达量
将-20℃冻存的菌体解冻后，取出100uL，10000rpm离心3min，弃掉上清，用40uL 2×上样缓冲液悬浮起来，按实验一和附录一进行SDS-PAGE电泳。 六、实验注意事项
在摇瓶实验中，停机特别是长时间停机会对发酵结果造成影响。在取样操作中，一要避免染菌，二要快速操作。 七、思考题
请区别表达量和蛋白总量的含义。
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实验七 工程菌发酵工艺
一、实验目的
了解和掌握基因工程蛋白药物发酵的一般工艺与发酵过程的参数控制。
二、实验原理
发酵是利用微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制备其菌体或代谢产物的过程。其本质是一种生化反应，与温度、pH、溶解氧、基质浓度等因素密切相关。对于应用基因工程技术改造的工程菌，在发酵表达时，还要考虑诱导条件如诱导起始菌浓度、诱导物浓度、诱导时间等对目的基因表达的影响。
本实验所采用的工程菌为人IL-18的大肠杆菌表达株，所含表达载体为pBV220，宿主株为DH5а，表达产物hIL-18的大小约为18KD。表达载体pBV200含有编码温度敏感性阻遏蛋白的ci857基因，在28-37℃时产生的阻遏蛋白能阻止强启动子PRPL的转录起始，细菌可以正常生长繁殖，当培养温度升高至42℃时该阻遏蛋白发生构象变化而失活，外源基因开始转录而表达，所以可以通过调控温度来诱导目的蛋白的表达。
上罐条件下，主要了解发酵的工艺和过程控制，只对生物量和目标蛋白表达进程进行分析。如采用摇瓶，则对培养基的起始pH值、基质浓度、诱导起始菌浓、诱导时间等影响目的蛋白的因素进行实验。
三、实验仪器
超净台、天平、离心机、温控摇床、发酵罐及周边设备、分光光度计、垂直电泳装置。
四、实验材料及试剂
hIL-18工程菌甘油种、蛋白胨、酵母抽提物、NaCl、氨苄青霉素（AP） EP管、培养皿、接种针、玻璃棒、滴头吸管、50ml和500ml离心管、10mL带盖螺口试管、500 mL摇瓶
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基因工程（跨课程）综合性实验
五、实验步骤 1. 菌种活化：
取低温保存的工程菌甘油种，按1%（v/v）接种量接种含2mlLB+AP培养基的螺口试管（10ml），37℃培养12hr。 2. 种子液制备： （1）
取活化菌种1ml接种于含100mlLB+AP培养基的摇瓶（1%接种量），37℃培养过夜
（2）
按10%（v/v）接种量将菌种过夜培养物接种于含100mlLB+AP培养基的摇瓶，共接种5瓶（500ml），37℃培养至对数中期（约需2.5hr， OD600约为0.6），作为种子液。
3. 发酵培养基配制与在位灭菌（提前一天）：
配制5L LB培养基，转入10L发酵罐，按121℃，30min条件在位高压蒸汽灭菌，待冷却至室温后方可接种。 4. 发酵参数设定：
采用温控型大肠杆菌表达系统常规发酵参数进行发酵，发酵参数设定为： 37℃培养3h，转换温度至42℃诱导表达5h，溶氧设定为30%以上，搅拌转速为300rpm。 5. 接种：
按无菌操作将培养好的500mL种子液接入到发酵罐中。 6. 发酵进程分析：
每组 8～9人，由带教老师介绍发酵过程控制，同时完成不同时段的取样。每组负责测定一个时间点的光密度值，同时制备8～9个平行样品供发酵进程分析用（SDS-PAGE），注意做好标记。第一次取样为1.1，1.2～1.8或1.9(根据每组人数)，第二次为2.1～2.8，其余类推。 每次取样约30ml,测光密度用2mL，1mL用于测定目标蛋白含量。 （1） （2）
光密度测定方法：波长为600nm时测定细菌的吸光值。
SDS-PAGE+凝胶扫描分析表达水平：参照附录一和工程菌表达筛选中的方法。
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