基因工程（跨课程）综合性实验
样品，称重，用无菌牙签挑取约牙签粗头大小，编号，溶于40ul1×SDS上样缓冲液中备用。
8、将包涵体按5%（W/V）的稀释度重新悬浮于包涵体洗涤缓冲液III，充分混匀，按1ml/管的装量将包涵体悬浮液分配至1.5ml EP管，-20冻存。
9、每个小组取包涵体样品1支，室温解冻，4℃，10000rpm，离心10min，弃上清，加入1ml包涵体裂解缓冲液，充分混匀，37℃保温3小时。4℃，10000rpm，离心10min（上清留样20ul，编号，加20ul2×SDS上样缓冲液；沉淀用无菌牙签挑取牙签粗头大小，编号，溶于40ul1×SDS上样缓冲液中备用）。 10、上清移至10ml试管，用缓慢滴加包涵体复性缓冲液至尿素终浓度为2M（稀释4倍），4℃过夜。
11、取100ul复性液于EP管，4℃，12000rpm，离心10min，上清取样20ul，编号，加20ul2×SDS上样缓冲液；沉淀加40ul1×SDS上样缓冲液，编号。 12、将上述1－7号样品进行SDS-PAGE分析（方法参照附件一）。
七、注意事项
1、使用超声波时应控制强度在一定的限度，即刚好低于溶液产生泡沫的水平。产生泡沫会导致蛋白质变性。
2、在复性蛋白时，要注意一定要缓慢加入包涵体复性缓冲液，以防止变化太快造成蛋白质聚集析出。
八、思考题
1、如何分离包涵体？ 2、蛋白质复性的方法有哪些？
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附录一、SDS－PAGE电泳
一、实验试剂
1、2×SDS上样缓冲液：0.1mol/LTris（pH6.8）、4％SDS、20％甘油、0. 2％溴酚篮、200mmol/L DTT（或4％β－巯基乙醇），4℃保存。 2、10％APS，TEMED和DTT存放在4℃冰箱。
3、10×电泳缓冲液：Tris 6g、glycine 28.8g、SDS 10g，pH调至8.3，定容至1L。 4、30％胶母液（Acr－Bis）：30％acrylamide、0.8％bis（即acrylamide 30g、bis 0.8g 定容至100ml），可在4℃存放数月。 5、分离胶缓冲液（pH8.8）：1.5M Trsi－HCl。 6、浓缩胶缓冲液（pH6.8）：1.0M Trsi－HCl。 7、10％SDS
8、考马斯亮篮染色液：1.25g考马斯亮篮R250、450ml甲醇：水（1：1）、50ml冰醋酸
9、脱色液：450ml甲醇：水（1：1）、50ml冰醋酸
二、实验方法
1、配制适量的12％的分离胶，以10ml为例：
H2O 3.3ml、30％胶母液 4.0ml、分离胶缓冲液（pH8.8）2.5ml、10％SDS 0.1ml、10％APS 0.1ml、TEMED 0.004ml。
2、将配制好的分离胶加入制胶槽中，注意应沿着边缘缓慢加入，千万别进气泡。凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5cm或距梳子齿约0.5cm处。
3、轻轻在分离胶溶液上覆盖一层双蒸水（或异丙醇）封胶，使凝胶表面变的平整，静止30min－1h，使凝胶聚合。凝胶聚合后，在分离胶和水层之间将会出现一个清晰的界面，可以微微倾斜模具，检测凝胶是否聚合。 4、除去上面的水层，再用滤纸吸尽残留的液体。 5、配制5％的浓缩胶，以5ml为例：
H2O 3.4ml、30％胶母液 0.83ml、浓缩胶缓冲液（pH6.8）0.63ml、10％SDS 0.05ml、10％APS 0.05ml、TEMED 0.005ml。
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6、迅速将配好的浓缩胶添加到分离胶上面，并将梳子插入凝胶内，至梳子齿的底部与前玻璃板的顶端平齐，小心避免混入气泡。将凝胶垂直放置于室温下，约30min凝胶聚合。
7、将胶板放入电泳槽 中，在上下电泳槽中添加1×电泳缓冲液，使凝胶的上下端均能浸泡在缓冲液中。轻轻拔出梳子，注意不要将加样孔撕破。
8、在电泳槽的泳道中分别添加蛋白Marker和样品20ul。加样时用微量移液器将样品加入样品孔的底部，避免带入气泡。
9、接通电源，上槽（加样孔端）接负极，下操接正极，恒流，起始电流20mA，待溴酚篮前沿进入分离胶，电流增加至30mA。
10、电泳大致需要1－3h（取决于凝胶孔径，特别是缓冲系统和电参数的选择）。待溴酚篮前沿到达电泳槽底部时，切断电源，从电极上拔掉电极插头，取出玻璃板。
11、带上手套，小心移去两玻璃之间的隔片，利用专用的铲子轻轻撬开玻璃板，小心从制胶板上将凝胶剥下，弃去浓缩胶。在右下角切去小片作为定位标记。 12、用清水洗胶，将分离胶放入染色液中缓慢摇动，染色20－30min，小心不要将胶撕破。由于SDS和蛋白质分子竞争染料而干扰考马斯亮篮染色，所以SDS凝胶的染色时间应比常规聚丙烯酰胺的时间要长，或用多倍体积的染色液，以排除SDS的影响。
13、从染色液中将凝胶取出用水漂洗后，将胶放入脱色液中进行扩散脱色，直到背景蓝色褪淡，见到条带，根据具体情况，大约换2－4次脱色液即可。
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六 重组DNA药物
基因治疗是外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的。随着DNA重组技术和转基因方法的不断完善，基因治疗研究发展迅猛，在某些疾病的治疗中取得了令人鼓舞的疗效。而用于基因治疗的DNA，分子量较大、带大量负电荷，这就使DNA的体内传递存在困难：分子尺寸较大，很难通过被动扩散进入细胞；所带的负电荷与细胞表面的负电荷相排斥，而易与带正电荷的血浆蛋白结合；另外DNA起作用的部位是细胞核，生物体内的核酶能够将细胞核外的游离DNA降解。说明DNA的传递需要载体的协助，不但要求能够突破进入细胞的重重障碍，还要求能够进入细胞核。因此，人们愈来愈认识到选择合适的载体，使目的基因安全、靶向、可控并有效表达，是基因治疗成功的关键。目前临床试验中所用的载体一般有两类：病毒载体和非病毒载体。虽然目前使用最多的仍然是病毒型载体，占所用载体总量的75%左右，其转染效率可达90%以上，但病毒载体存在潜在的安全性问题，如能诱导宿主免疫反应及潜在的致癌性，同时它制备复杂，所能装载的外源DNA大小有限，使其应用受到很大限制。尤其是1999年出现首例使用腺病毒载体进行基因治疗导致病人死亡事件发生后，关于病毒载体的安全性问题更是成为研究者关心的重点，于是，人们更加关注非病毒型载体的研究。非病毒载体具有低毒安全的特点且适合特殊治疗目的，它们能够携带大量DNA分子，容易大批量生产，费用低廉，对于非病毒基因载体的研究目前主要有：裸露的DNA；阳离子脂质体；阳离子聚合物等。
本综合实验以质粒pCDNA3.1-TCRVβ7.1为例，介绍质粒DNA大规模制备、阳离子脂质体与质粒DNA复合物制备、T细胞体外转染、转染T细胞目的基因表达和体外活性检测、体内给药试验等。
背景知识
1、重组DNA技术
重组DNA技术属于遗传工程分子水平的遗传操作，是一种按照人的意志定
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向改变生物遗传性状的技术。是在体外重新组合DNA分子(脱氧核糖核酸)，并使其在适当的细胞中增殖的遗传操作，这种操作可将特定的基因组合到载体上，并使其在受体细胞中增殖和表达。重组DNA技术基本过程：
a、用人工方法取得或合成目的基因
基因是含特定遗传信息的核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位，基因可被分离出来 。基因的合成主要有化学合成和酶促合成两种方法。
b、运载体的选择
运载体的作用是将分离或合成的基因导入细胞或能转移染色体上的DNA片段，所以它必须能自由出入细胞，常用的运载体有SV40病毒，温和噬菌体和质粒等，但最常用的是质粒。质粒是染色体以外能够自主复制的遗传单元，是由双链DNA分子组成，呈环状结构。它可以游离于细胞浆中，也可与染色体整合在一起，它没有蛋白质外套，是裸露的DNA分子，它比染色体小，只带数个或数10个基因，最大的也只有大约100个基因，它上面有一个位点称为原点，可以携带染色体转移。
c、质粒的分离与重组DNA
用溶菌酶裂解菌细胞分离出质粒。用内切酶处理质粒，使它的DNA在一定位置上断裂，并在断裂口出现粘性末端。用同样的内切酶处理分离出的目的基因的DNA，使之具有相同的粘性末端与质粒粘性末端相连接，形成重组DNA稳定结构。将重组DNA导入不含质粒的细菌，即受体细菌中，例如大肠杆菌(F )中，目的基因能随质粒复制而复制，并随细菌的分裂而扩增，形成这一基因的无性繁殖系一重组DNA克隆化。
2、阳离子脂质体
阳离子脂质体作为基因治疗的载体是目前研究的热点之一，其转染率比pH 敏感脂质体高3～150 倍。选用材料多为二油酰基磷脂酰乙醇胺(DEOP) ，阳离子表面活性剂有溴化十六烷基三甲基铵( CTAB) ，溴化双十二烷基二甲基铵(DDAB12) ，溴化双十八烷基二甲基铵(DDAB18)，氯化N-(1-(2 ,3-双油酸基) 丙基-N ,N ,N 三甲基铵等。所有的阳离子脂质体都带有一个疏水基团，该基团一般是一至两个脂肪酸或是长约12-18个碳原子的烷基单元或是一个胆固醇单元。疏
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