拟南芥Ferrodoxin基因与甜菜曲顶病毒(BCTV)作用机制研究

￥７６７７０１中山大学硕士学位论文拟南芥Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ基因与甜菜曲顶病毒（ＢＣＴＶ）作用机制的研究学位申请人姓名：姜威导师姓名及职称：谢旗教授专业：植物分子生物学答辩委员会委员（签名）主席谋Ｖ委员缎一一扒ｊ谄鸟纭ｊｊ中山大学生命科学学院小国．广卅ｆ：零零赢年五月摘要双生病毒（Ｇｅｒｍｉｎｉｖｉｒｕｓ）是一组具有双生颗粒形态的单链环状ＤＮＡ植物病毒，ＢＣＴＶ（Ｂｅｅｔｃ”咖ｔｏｐｖｉｒｕｓ，甜菜曲顶病毒）是双生病毒ＩＩ亚组的成员之一，双生病毒侵染范围十分广泛，感病植株一般表现为花叶、曲叶、黄化等症状，严重地影响了植物的正常生长，对农业生产造成巨大的危害。本研究以ＢＣＴ７中的ｃ２蛋白为诱饵，证明了在酵母双杂交体系中，有ＡＰ２，Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ和ＳＡＭＤＣ三个蛋白能够和Ｃ２蛋白发生相互作用。为了寻找ｃ２蛋白和Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ蛋白发生相互作用的具体结构域，本研究分别对ｃ２蛋白和Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ蛋白进行了Ｎ末端和Ｃ末端的切除，切除后的质粒重新共转化入酵母中，结果表明Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ蛋白与Ｃ２蛋白发生作用的结构域分别为Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ蛋白的Ｃ末端和Ｃ２蛋白的Ｃ末端。本研究还得到了高表达Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ基因的拟南芥以及敲除Ｆｅｒｒｏｄｉｘｎ基因拟南芥。比较野生型拟南芥和高表达拟南芥的生长情况，可以看到高表达拟南芥比野生型拟南芥生长更快，植株更大。比较野生型拟南芥和高表达拟南芥的根的长短，可以观察到高表达拟南芥的根相对于同期野生型拟南芥的根更长，更发达。比较野生型拟南芥和高表达拟南芥的鲜重，高表达拟南芥要相对于野生型拟南芥的鲜重更重。因此可以得出结论：Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ基因能够正向调节拟南芥的大小，根长以及鲜重。同时实验现象表明，高表达拟南芥的抽苔时间相对野生型拟南芥的抽苔时间有所推迟，说明高表达拟南芥的营养生长期被延长。用ＢＣＴＶ同时侵染高表达拟南芥和野生型拟南芥，计算拟南芥半数感染时间，野生型拟南芥的半数感染时间为十天，而高表达拟南芥半数感染时间是十三天。表明Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ基因表达能够推迟拟南芥被ＢＣＴＶ感染后的症状。敲除Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ基因拟南芥子叶相对于野生型拟南芥子叶会发生形态会发生改变，例如植株的对称性会发生变化，子叶会出现缺裂。由此可以说明，Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ的表达量会影响拟南芥的予叶的形态。关键词：铁氧还蛋白，拟南芥，甜菜曲项病毒，酵母双杂交ＡｂｓｔｒａｃｔＧｅｍｉｎｉｖｉｍｓｅｓｖｉｒｉｏｎｓｄｉｓｐｌａｙｉｎｇａｒｅａｆａｍｉｌｙｏｆｐｌａｎｔｖｉｒｕｓｅｓｔｈａｔｅｎｃａｐｓｉｄａｔｅｃｉｒｃｕｌａｒｓｓＤＮＡｗｉｔｈｃａｎａｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｇｅｍｉｎａｔｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ．Ｔｈｅｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓｅｓａｓｉｎｆｅｃｔａｌａｒｇｅｎｕｍｂｅｒｏｆｐｌａｎｔｓｐｅｃｉｅｓ，ｃａｕｓｉｎｇｖａｒｉｏｕｓｓｙｍｐｔｏｍｓｓｕｃｈｍｏｓａｉｃｌｅａｆ，ｃｕｒｌｙｔｏｐａｎｄｅｔｉｏｌａｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈｂａｄｌｙｉｍｐａｃｔｔｈｅｎｏｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｏｆｐｌａｎｔｓａｎｄｐｒｏｄｕｃｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｏｓｓｅｓｉｎａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．．ＢｅｅｔＣＵｒｌｙｔｏｐｖｉｒｕｓ（ＢＣＴＶ）ｕｓｅｄｉｎｏｕｒｒｅｓｅａｒｃｈｉｓａｍｅｍｂｅｒｏｆｓｕｂｇｒｏｕｐＩＩｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓｅｓ．Ｂａｓｅｄｏｎｙｅａｓｔｔｗｏ—ｈｙｂｄｄａｓｓａｙｕｓｉｎｇＣ２ｐｒｏｔｅｉｎｏｆＢＣＴＶａｓａｂａｉｔ，ｓｃｒｅｅｎｅｄｂｙｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａｃＤＮＡｌｉｂｒａｒｙ，ＡｔＡＰ２，ＡｔＦｅｒｒｏｄｏｘｉｎａｎｄＡｔＳＡＭＤＣｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａｒｅｆｏｕｎｄｔＯｉｎｔｅｒａｃｔｓｐｅｃｉｆｉｃｌｙｗｉｔｈＣ２ｐｒｏｔｅｉｎ．ＴｏｆｕｒｔｈｅｒｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎＢＣＴＶＣ２ａｎｄＡｔＦｅｒｒｏｄｏｘｉｎ，ｗｅｕｓｅｄｔｈｅｙｅａｓｔｔｗｏ—ｈｙｂｒｉｄｓｙｓｔｅｍｔｏａｎａｌｙｓｅｗｈｅｔｈｅｒｔｈｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｏｃｃｕｒｓａｔｔｈｅＮｔｅｒｍｉｎｕｓｏｒＣｔｅｒｍｉｎｕｓｏｆＢＣＴＶＣ２ａｎｄＡｔＦｅｒｒｏｄｏｘｉｎ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＴｈｅｄｅｌｅｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔｔｈｅＣ—ｔｅｒｍｉｎａｌｒｅｇｉｏｎｏｆＢＣＴＶＣ２ｉｎｔｅｒａｃｌｓｗｉｔｈｔｈｅＣ—ｔｅｒｍｉｎａｌｏｆＡｔＦｅｒｒｏｄｏｘｉｎ．ＴｏｆｕｒｔｈｅｒｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆＡｔＦｅｒｒｏｄｏｘｉｎ，ｔｈｅＡｔＦｅｒｒｏｄｏｘｉｎｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｋｎｏｃｋ—ｏｕｔｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓａｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｉｎｔｈｅｐｒｉｌｉｍｉｎａｒｙｐｈｅｎｏｔｙｐｅａｎａｌｙｓｉｓ，ｔｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓｏｆＡｔＦｅｒｒｏｄｏｘｉｎｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｇｒｏｗｆａｓｔｅｒａｎｄｂｉｇｇｅｒｓｕｇｇｅｓｔｓｔｈａｎｗｉｌｄｔｙｐｅａｃｃｏｒｄｉｎｇＡｔＦｅｒｒｏｄｏｘｉｎｔＯｔｈｅｆｌｅｓｈｗｅｉｇｈｔａｎｄｔｈｅｌｅｎｇｔｈｏｆｒｏｏｔ，ｗｈｉｃｈｒｅｇｕｌａｔｅｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｔｈａｔｍａｙｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙＭｅａｎｗｈｉｌｅ，ｔｈｅｂｏｌｔｉｎｇｔｉｍｅｆｏｕｎｄｔｏｂｅｌａｔｅｒｏｆｔｈｅＡｔＦｅｒｒｏｄｏｘｉｎｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓｗａｓｔｈａｎｗｉｌｄｔｙｐｅ，ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇｔｈａｔｔｈｅｖｅｇｅｔａｔｉｖｅｐｅｒｉｏｄｔｈｅｗａｓｄｅｌａｙｅｄ．Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ－?ｍｅｄｉａｔｅｄｓｐｒａｙ—－ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎａｓｓａｙｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔＢＣＴＶ－ｉｎｆｅｃｔｅｄｓｙｍｐｔｏｍｓｗｅｒｅｄｅｌａｙｅｄｄｕｅｔＯｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＡｔＦｅｒｒｏｄｏｘｉｎ．Ｏｎｔｈｅｏｔｈｅｒｈａｎｄ，ｔｈｅｓｈａｐｅｏｆｃｏｔｙｌｅｄｏｎａｎｄｔｈｅｓｙｍｍｅｔｒｙｏｆＡｔＦｅｒｒｏｄｏｘｉｎｋｎｏｃｋ—ｏｕｔｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓａｒｅｆｏｕｎｄｔｏｂｅｉｍｐａｃｔｅｄ，ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＡｔＦｅｒｒｏｄｏｘｉｎｍａｙａｆｆｅｃｔｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄ：Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ，Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ，Ｂｅｅｔｃ“ｒｌｙｔｏｐｖｉｒｕｓ．ＹｅａｓｔｔｗｏｈｙｂｒｉｄⅡ缩略词与英汉对照缩写ＡｍｐＡＡｂｐｃＤＮＡＣＭｍＭｄｄＨ２０ＤＭＳｏＥＢ最ｃｏｌｉＧＡＬ４．ＡＤＧＡＬ４一ＢＤＨｉｓＫａｎＬＢＬｅｕＬｉＯＡｃＯ．Ｄ．ＰＥＧＳ．ｃｅｒｅｖｉｓ／ａｅＳＤＴＢＥＴＥＴｒｐＸ－ｇａｌＹＰＤＰＣＲｋｂＣａｒＥＤＴＡ全称ＡｍｐｉｃｉｌｌｉｎＡｍｉｎｏａｃｉｄＢａｓｅｐａｉｒｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙＤＮＡｃｏｍｐｌｅｔｅｍｅｄｉｕｍＭｉｌｌｉｍｏｌａｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｄｏｕｂｌｅｄｉｓｔｉｌｌｅｄｗａｔｅｒｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅｅｔｈｉｄｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＧＡＬ４一ＡｃｔｉｖａｔｉｎｇＤｏｍａｉｎＧＡＬ４一ＢｉｎｄｉｎｇＤｏｍａｉｎｈｉｓｔｉｄｉｎｅＫａｎａｍｙｃｉｎｅＬｕｄａ—ＢｅｒｔａｎｉｍｅｄｉｕｍｌｅｕｃｉｎｅＬｉｔｈｉｕｍａｃｅｔａｔｅＯｐｔｉｃａｌＤｅｎｓｉｔｙｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌＳａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＳＤｍｅｄｉｕｍＴｄｓＢｏｒａｔｅＥＤｌ’ＡＴｄｓＥＤＴＡｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ５．ｂｒｏｍｏ－４一ｃｈｌｏｒｏ?３－ｉｎｄｏｙｌ?Ｂ－Ｄ—ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅＹｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ，Ｐｅｐｔｏｎｅ，ＤｅｘｔｒｏｓｅＰｏｌｙｍｅｒａｓｅｅｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎＫｉｌｏｂａｓｅＣａｒｔ｝ｅｎｃｉｌｌｉｎＥｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ乙二胺四乙酸汉语意思氨苄青霉素氨基酸碱基对与ＲＮＡ互补的ＤＮＡ完全培养基毫摩尔浓度双蒸水二甲基亚砜溴化乙锭大肠杆菌ＧＡＬ４一（ＤＮＡ转录）激活域ＧＡＬ４．（ＤＮＡ）结合域组氨酸卡那霉素ＬＢ培养基亮氨酸醋酸锂光学浓度聚乙二醇酿酒酵母ＳＤ培养基硼酸电泳缓冲液三羟基甲基氨基甲烷一乙二胺四乙酸色氨酸５．溴．禾氯．３．吲哚．Ｂ．Ｄ．半乳糖苷酵母提取物，大豆蛋白胨，葡萄聚合酶链式反式千碱基羧苄青霉素ⅣａｃｉｄＭｕｒａｓｈｉｇｅａｎｄｓａｌｔｍｉｘｔｕｒｅＳｋｏｏｇｂａｓａｌＭＳ基本盐Ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ利福平Ｖ