拟南芥Ferrodoxin基因与甜菜曲顶病毒(BCTV)作用机制研究(8)

姜威中山大学硕士论文拟南芥Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ基因与甜菜曲顶病毒（ＢＣＴＶ）作用机制的研究本实验设计了Ｆｅｒｒｏｘｏｉｎ基因的５’引物和３’引物，分别在Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ的５’引物中设计了ＥｃｏＲＩ酶切位点，在Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ的３’引物中设计了ＸｈｏＩ酶切位点得到ＰＣＲ产物后用ＥｃｏＲＩ和ＸｈｏＩ双酶切，然后克隆到ｐＧＡＤＧＨ表达载体中。Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ５，引瓤ｃ圃Ｔ固ＧＣＴＴＣＣＡＣＴＧＣＴＣＴＣＴｔｔｅｏ嚣Ｉｒｍ斋５９Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ３’；ｉ物：ｃｃｃ匝盈圃ＡＡＣＡＡＴＧＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＴＧＴＸｈｏＩＴｉｎ－５８用ＰＣＲ方法获得Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ片段路线图如图２．７所示。得到的ＰＣＲ产物电泳鉴定．大小为４５０ｂｐ左右（如图２—８所示）。酵母表达载体ｐＧＡＤＧＨ—Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ构建路线图如图２－９所示。表达载体ｐＧＡＤＧＨ用ＥｃｏＲＩ和ＸｈｏＩ双酶切（如图２．１０所示），用凝胶回收试剂盒回收目的片段，ＦｅｒｒｏｄｏｘｉｎＰＣＲ产物用ＥｃｏＲＩ和ＸｈｏＩ双酶切，将两组份的回收产物混合在一起，按载体和插入片段摩尔比为３：ｌ的摩尔量，用Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，连接产物化学法转化入池』．ｂｌｕｅ感受态细胞，在ＬＢ抗性平板上获得若干白色菌落扩大培养，用菌液ＰＣＲ的方法检测插入片段（如图２－１１所示），提取质粒，用ＮｃｏＩ和ＥｃｏＲＩ双酶切（如图２—１２所示），质粒送上海博亚公司测序，测序结果与预期结果相符，证明表达载体ｐＧＡＤＧＨ．Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ构建成功。３ｌ姜威中山大学硕士论文拟南芥Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ基因与甜菜曲顶病毒（ＢＣＴＶ）作用机制的研究旦堡芷塑．ＦｅｒｒｏｄｏｘｍＦｅｒｒｏｄｏｘｉｎ一５’引物和Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ一３’引物图２．７用ＰＣＲ方法获得Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ基因片段路线图ｌ●｛７ｂｐ—－｛蛐一¨ｄ—Ｉｌｄ图２．８用ＰＣＲ方法获得Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ基因电泳图Ｌａｎｅｌ：Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ片段Ｌａｎｅ２：ｌｋｂＤＮＡＬａｄｄｅｒ３２姜威中ｉｌｌ大学硕士论文拟南井Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ基因与甜菜曲顶病毒（ＢＣ＇Ｉｖ）作用机制的研究＝＝＝＝＝＝＝＝ｌＥｃｏ胁ｘ㈨双酶切彰』ｒ＆。肌Ⅻ。。双酶切－－＿＿●＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿一●●－＿＿＿＿＿●＿＿●＿■＿＿＿一…一。，，。竺≮遵笸銎。４、。．，”＝ＦⅢｏ∞ｄｎｐＧＡＤＧＨ—Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ…“”×。＝：’，。ｉ蔫摹嚣…‘ｋ…妒，足，图２－９表达载体ｐＧＡＤＧＨ．Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ的构建路线图３３姜威中山大学硕士论文拟南芥Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ基因与甜菜曲顶病毒（ＢＣＴＶ）作用机制的研究１００００－７５０ｐ一８０００ｂｐ２５００一图２．１０表达载体ｐＧＡＤＧＨ用ＥｃｏＲＩ和ＸｈｏＩ双酶切电泳图Ｌａｎｅｌ：ｌｋｂＤＮＡＬａｄｄｅｒＬａｎｅ２：ｐＧＡＤＧＨ／ＥｃｏＲＩ和ＸｈｏＩ双酶切５００＿２５０－一４４７ｂｐ图２－１１ｐＧＡＤＧＨ－Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ菌液克隆ＰＣＲ检测电泳图Ｌａｎｅｌ：ｌｋｂＤＮＡＬａｄｄｅｒＬａｎｅ２—７：ｐＧＡＤＧＨ—Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ菌液ＰＣＲ克隆检测姜威中山大学硕士论文拟南芥Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ基因与甜菜曲顶病毒（ＢＣＴＶ）作用机制的研究ｌｈｐ２￥００－—３００ｂｐ图２?１２酵母表达载体ｐＧＡＤＧＨ－Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ酶切图谱Ｌａｎｅｌ：ｌｋｂＤＮＡＬａｄｄｅｒＬａｎｅ２：ｐＧＡＤＧＨ－Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ／ＮｃｏＩ和ＥｃｏＲＩ双酶切为了研究Ｃ２蛋白与Ｆｅｒｒｏｄｉｘｎ蛋白发生作用的结构域，构建了ｐＧＡＤＧＨ—Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ?Ｎ利ｐＧＡＤＧＨ—Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ—Ｃ两个表达载体，构建示意图如图２－１３所示。表达载体ｐＧＡＤＧＨ—Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ—Ｎ的构建路线图如图２－１４所示。表达载体ｐＧＡＤＧＨ—Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ—Ｃ的构建路线图如图２一１５所示。ＳｌｍＩＤＧ冉量畦｝卜Ｆ毫ｒｐｏｄｏｘｉｎ（１一哇哇７）ｐＧＡＩ）Ｇｌｔ—Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ—Ｋ（ｔ－１５４）Ｉ孵ＡＩ）ＧＩｔ－Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ－Ｃ（１５４—４４７）ＮｅｏｌＸｈｏｌ图２—１３酵母表达载体ｐＧＡＤＧＨ－Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ构建示意图３５