拟南芥Ferrodoxin基因与甜菜曲顶病毒(BCTV)作用机制研究(4)

姜威中山大学硕士论文拟南芥Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ基因与甜菜曲顶病毒（ＢＣＴＶ）作用机制的研究本实验技术路线图－３：［巫夏至三三亟堕口匝匣亘困ｌｐＧＡＤＧＨ－Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ—Ｎｌ表达载体构建ｐＧＡＤＧＨ－Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ—?Ｃ表达载体构建＼心钐／酵母双杂交ｐＧＢＫＴ７一Ｃ２一Ｎ表达载体构建ｐＧＢＫＴ７一Ｃ２一Ｃ表达载体构建构建姜威中山大学硕士论文拟南芥Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ基因与甜菜曲顶病毒（ＢＣＴＶ）作用机制的研究第二章Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ蛋白与Ｃ２蛋白在酵母双杂交系统中的作用实验２．１材料与方法２．１．１材料２．１．１．１菌株材料（１）本实验中所用的酵母菌株是酿酒酵母Ｓａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＨＦ７ｃ（ＭＡＴａｕｒａ３?５２ｈｉｓ３－２００ａｄｅ２—１０１ｔｙｓ２—８０１ｔｒｐｌ一９０１ｌｅｕ２?３．Ｊ１２ｇａｌ４—５４２ｇａｌ８０－５３８ＬＹＳ２：：ＧＡＬＩＵＡｓ．ＧＡＬｉＴＡｚＡ—ＨＩＳ３ＵＲＡ３：：ＧＡＬ４１７ｒｅｅｆｓ｛ｘ３）－ＣｙＣＩＴＡＴＡ—Ｌ８ｃｚ）．台有ＬａｃＺ和ＨＩＳ３报告基因。（２）大肠杆菌Ｅ．ｃｏｌｉ：ＸＬ．Ｊｂｌｕｅ感受态细胞２．１．１．２质粒材料本实验用了两个载体：ｐＧＢＫＴ７和ｐＧＡＤＧＨ。（１）ｐＧＢＫＴ７载体表达融合到ＧＡＬ４ＤＮＡ结合域（ＤＮＡ—ＢＤ）ｌ一１４７位氨基酸的蛋白。酵母中融合蛋白在ＡＤＨｌ启动子（ＰａｏＨ』）诱导下有着高水平的表达；转录水平由盯和ＡＤＨｌ转录决定信号（丁ｂ＆＾ＤＨｆ）决定。ｐＧＢＫＴ７也含有”启动子，和一个ｃ－Ｍｙｃ抗原决定簇标记、一个多克隆位点ＭＣＳ（ｍｕｌｔｉｐｌｅｃｌｏｎｅｓｉｔｅ）。ｐＧＢＫＴ７在Ｅｃｏｌｉ和工ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中都可分别以ｐＵＣ和ｏｒｉ自主复制。ｐＧＢＫＴ７在Ｅｃｏｌｉ中含有Ｋａｎ选择抗性，在酵母中则有ＴＲＰｌ选择性营养标记。１２姜威中山大学硕士论文拟南芥Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ基因与甜菜曲顶病毒（ＢＣＴＶ）作用机制的研究Ｈｉｎｄ＾ｃ－ＭｙｅｅｐｌｔｏｐｅｔａｇｐＧＢＫＴ７质粒图谱’岂兰竺兰兰竺！兰垒！竺！！竺！！！！！！！．１【：＾ＴＣＯＢ＾ＡａＡＧＡＧＴ＾ＧＴ＾＾Ｃ＾＾＾口日ＴＣ＾ＡＡＧＡＣ＾ＧＴＴ日＾ＣＴＢＴ＾ＴＣＧＣＣ日口ＡＡｌＴｒ＝Ｌｉ百；；Ｆ＿！坚竺竺虫业‰．８ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴｃＡＣＴＡＴＡ日ＧＧＣＧＡ０ｎｅ。：．＿。刚即佃Ｂ既＾Ｔｃ６口ＢＡＢ螺薯一ＧＡＧ．１，．箸等黜篙器警器掣巴警““““嚣篇～““＿ｈ㈣ｈｏＴＦＧＧＧＧＣＣＴＣＴＡＡＡＣＧＧＧＴＣＴＴＧＡＧＧＧＧＣＡＧＡＡＧＩ；ＴＢ＾ｒｃｌｃ＾ＱＡＧＧＡＧＧＡＧＣＴ＇ＧｍｐＴ１下ｒｒＸＧＣＧＣＧＣＴＴＧＣＡＧＣＣＡＡＧＣＴＡＡＴＴＣＧＧＧＧＣＧＡＡＴｉ＇ＴＣＴＴＡＴＧＡＴＲ＂ｌｄｔＳＡＴ６＾ＴＴＴ丌＾丌ＡＴｉ－ＡＡＡＴＡＡＧＴｒ＾ＴＡＡＡ枷Ａ＾ＴＡＡ６ＴＢＴ乓ＴＡＣＡＡ＾ＴＴ兀Ｍ＾ＢＴＢ＾ＣＴＣＴＴ硒６＿Ａ＾ＡｃＧＡＡＡ＾．ｆ喇‘●ＤＳｑｕｍｎｍｉｎＵ＾ｈｐＧＢＫＴ７的多克隆位点图（２）ｐＧＡＤＧＨ载体携带一个含有ＧＡＬ４转录激活结构域７６８．８８１位氨基酸的杂合蛋白。ｐＧＡＤＧＨ在编码转录激活结构域的开放阅读框的３’端多克隆位点区域拥有独特的限制性位点。为了构建杂合蛋白，编码感兴趣的诱饵基因（或者ｃＤＮＡ库）将以正确的方向和正确的阅读框被连接到多克隆位点区域，从而形成一个融合蛋白。融合蛋白在酵母宿主细胞中在ＡＤＨｌ启动子诱导下高水平表达；转录由ＡＤＨｌ转录决定信号决定。杂合蛋白由加入到异源激活区域的核定位序列介导锚定到酵母细胞核上（Ｃｈｉｅｎｅｌａ１．，１９９１）。ｐＧＡＤＧＩ－［是一个在Ｅｃｏｌｉ和量ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ都可以自动复制的穿梭载体。它带有ｂｌａ基因（使得在Ｅｃｏｉｌ有氨苄青霉素抗性）和１３姜威中山大学硕士论文拟南芥Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ基因与甜菜曲顶病毒（ＢＣＴＶ）作用机制的研究ＬＥＵ２营养标记（使得携带有ｐＧＡＤＧＨ的酵母营养缺陷株可以在缺少Ｌｅｕ的限制型培养基上可以生长）。ＭＣＳ烈ＳｍｌＨｉａＪ”ＳＩ?ｎ斓ｌ妇，Ｉ胁Ｉ舢ＩＡ．ｔｌＪ＾盯冉ＣＣ＾ＣＴ鼻Ｃ＾＾１口Ｂ＾丁Ｇ＾Ｔ盯＾１ＡＴ＾＾Ｃ１．＾ＴＣｒＡ丌Ｃ—』坐坚型堕迹斗∞¨∞ｐＧＡＤＧＨ质粒图谱ｍＴＣ●劓础￡■ｒ柚Ｌ口－Ｉ＿ｎＲｔ－■帽，＆月＇ｑＭｉｗｔｔＧ＾丁ＧＡＴＧ＾＾ＧＡ丁ＡＣＣＣＣ＾ＣＣＡ＾＾ＣＣＣ＾＾＾＾＾＾＾Ｇ＾Ｇ＾ＴＧＣＴＡＧ＾＾Ｃ１＾ｆｉＴＧＧＡＴｅＣＧＧｅＧ口ＧｅＴｆｉＣＡＧＧ］面ｒ＿－磊而—丽一’蟊—１忑Ｔ＿１蕊丁。ＭＴｒＣＧｃＧｃｒＡＴＪ鱼宣ＡＴＡ—Ｃ１磊而—１ｊｒ一１丽广—面ｉ广■矿—矿ｒＧ＾ＧＴＣＧＴ＾ＴＴ＾Ｃ＾＾ＴＴＣ＾ＣＴＧＧＣＣＢ１℃：ＴＴＴｒＡ＾＾Ｇｃ丁ｒ＾ＴｃＧＡＴＡｃｃＧＴＣ日＾ｃｃＴＣＧ＾Ｇ台舀０ＢＧＢＥＥＣＧＢ１．Ａｃｃｃ＾ＡＴＴｃＧ霖露Ｃ，～ａＪＣＧＴＣＧＴＧ＾Ｃ１１１ＧＧ＾＾＾＾ＣＣＣＴ●Ｇ＾ＴＣｒ＾ＴＧ＾ｊＩＴＣ￥１ＤＰｉｉｌｔｌ，ｒ－｜ｌ！！！！！竺塑！！！！Ｇ１．＾Ｇ＾Ｔ＾ＣＴＧ＾＾＾＾Ａ口０ＣＣＧＧ＾＾ＧＴＴＣ＾ＣＴＴＣ飘＾：ＴＧＴＧＧ＾ＴＣＧｒＧｃＡｂ＇ｌ腽ＰＩⅡＲＦａｐＧＡＤＧＨ多克隆位点图（３）携同ＤＮＡＳｏｎｉｃａｔｅｄｓａｌｍｏｎｓｐｅｒｍｃａｒｒｉｅｒＤＮＡ（来自ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥＴＭ公司）２．１．１．３培养基和其他所需的溶液１４姜威中山大学硕士论文拟南芥Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ基因与甜菜曲顶病毒（ＢＣＴＶ）作用机制的研究ＬＢ培养基：每５００ＮａＣＩｍＬＬＢ培养基含胰蛋白胨Ｔｒｙｐｔｏｎｅ５克，酵母浸出液Ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ２．５克，ｎｉＬ５克，用１０ＮＮａＯＨ调ｐＨ至７．０－７．２。固体５００ＬＢ培养基再加入７．５克琼脂粉。ＳＤ培养基（ＣＭ）：每ｌＯＯｍｌｓＤ培养基含Ｏ．７９（加有（ＮＨ４ｈＳ０４）酵母氮碱（ＹｅａｓｔＮｉｔｒｏｇｅｎＢａｓｅ），１０ｘＣＭ．Ｔ—Ｌ—Ｈｉｓ母液１０ｍｌ，２．０克琼脂粉。用ＩＭＫＯＨ调ＰＨ至ＩＪ６．５。１２１。Ｃ１５分钟高压灭菌，冷却到６０。ｃＩＮ／Ｘ．５ｍｌ４０％（无菌）葡萄糖ＣＭ，－Ｔｒｐ，一ＬｅｕＣＭ，一Ｔｒｐ，一Ｌｅｕ，－ＨｉｓＬＢ，ＬＢ＋Ａｍｐ（１００ｍｇ／ＬＹＰＤｏｒ７５ｒａｇ／Ｌ），ＬＢ＋Ｋａｎ（５０ｍｇ／Ｌ）ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）：ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ二甲基亚砜无菌去离子水１０Ｘ１０ＸＴＥ缓冲液（１００ｍＭＴｒｉｓ，１０ｍＭＴＥ／ＬｉＯＡｃ溶液，（无菌）ＥＤＴＡ，ＰＨ８．Ｏ），ｓｔｅｒｉｌｅ４０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ４０００１０．１ＭＴＥ／ＬｉＯＡｃ（在酵母转化前新鲜配备，过滤灭菌）酚，氯仿，ｐＨ８．０含有２ｍｆｆｍｌ５－溴一４一氯一３一吲哚一Ｂ．Ｄ一半乳糖苷（ｘ—ｇａｌ）的ｚ缓冲液Ｚｂｕｆｆｅｒ（ＩＬ，ｐＨ７．０，不用灭菌）配方：６０ｍＭＮａ２ＨＰ０４－７Ｈ２０４０ｍＭＮａ２ＨＰ０４?Ｈ２０１０ｍＭＫＣｌ１ｒａＭＭｇＳ０４?７Ｈ２０５０ｒａＭ２－巯基乙醇