拟南芥Ferrodoxin基因与甜菜曲顶病毒(BCTV)作用机制研究(7)

姜威中山大学硕士论文拟南芥Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ基因与甜菜曲顶病毒（ＢＣＴＶ）作用机制的研究２．２．２酵母表达载体ｐＧＢＫＴ７一Ｃ２－Ｎ和酵母表达载体ｐＧＢＫＴ７－Ｃ２一Ｃ的构建为了研究ｃ２蛋白与Ｆｅｒｒｏｄｉｘｎ蛋白发生作用的结构域，分别对酵母表达载体ｐＧＢＫＴ７．Ｃ２和酵母表达载体ｐＧＡＤＧＨ．Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ进行了切除重新构建。酵母表达载体ｐＧＢＫＴ７一Ｃ２如图２－１所示。酵母表达载体ｐＧＢＫＴ７．Ｃ２一Ｎ的构建路线图如图２．２所示。酵母表达载体ｐＧＢＫＴ７．Ｃ２．Ｃ的构建路线图如图２—３所示。为了构建ｐＧＢＫＴ７一Ｃ２．Ｎ表达载体，用ＳａｌＩ和ＥｃｏＲＩ进行双酶切，切掉的片段大小为２９０ｂｐ（如图２４所示）。ｐＧＢＫＴ７一Ｃ２一Ｃ的构建用ＮｄｅＩ和ＥｃｏＲＩ进行双酶切，切掉的片段大小为２３０ｂｐ（如图２－４所示）。连接产物化学法转化入ＸＬｌ一ｂｌｕｅ感受态细胞，在ＬＢ抗性平板上获得若干白色菌落扩大培养，提取质粒，质粒送上海博亚生物技术公司测序，测序结果和预期结果一致。最终证明ｐＧＢＫＴ７．Ｃ２一Ｎ表达载体和ｐＧＢＫＴ７一Ｃ２．Ｃ表达载体构建成功。图２－１酵母表达载体ｐＧＢＫＴ７?Ｃ２姜威中山大学硕士沦文拟南芥Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ基因与甜菜曲顶病毒（ＢＣＴＶ）作用机制的研究＾ｐ。ｕｍｗ）——，ｋｐＧＢＫＴ７一Ｃ２ｋ—ｂ４ⅡＱ７ｐ）；Ｈ≯‘ｌＷＫｌｅｎｏｗ补平补平‘Ｔ４连接酶连接‘口＿一＝２。＊。／Ⅻ№”。啪”“”ｏ—ｏ、、、≯。ｐＧ８ＫＴ７一Ｃ２－Ｎ５缸ｂ｜。？Ｚ夕。…”‘／晓“７熏、姬Ｉ（１ｓ８舢——一—ｉ自姐Ⅱ（ｉ８＆ｄ）＿ｒ＿”ｏ””黛时。Ｋａｎ＼、’卸口ｎ０５３７郇呻图２－２酵母表达载体ｐＧＢＫＴ７．Ｃ２－Ｎ的构建路线图２７姜威中山大学硕士论文拟南芥Ｆｅｒｒｏｄｏｌｉｎ基因与甜菜曲顶病毒（ＢＣＴＶ）作用机制的研究枷俐嘶¨～》碰ｎｄⅡ１６０９７＞＾Ｐ４“＊２２７Ｌ一—‰～“。／≯、，ｊｋ知ｕ铆。）“＿＿ｎ’’啼一一∥’Ｋａ¨ｌＮｄｅＩ和ＥｃｏＲＩ双酶切ＩＫｌｅｎ吉ｗ朴平Ｔ４。芯Ａ连接酶‘＾ｐｍＪ（６，４８）＼。—螂ｕ”“晰’一—／、“ａＩ｝０４８５）’—＿‘ｐ。图２－３酵母表达载体ｐＧＢＫＴ７一Ｃ２－Ｃ构建路线图姜威中山大学硕士论文拟南芥Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ基因与甜菜曲顶病毒（ＢＣＴＶ）作用机制的研究２３５００ｂｐ２５０ｂｐ图２－４酵母表达载体ｐＧＢＫＴ７一Ｃ２酶切电泳图Ｌａｎｅｌ：ｌｋｂＤＮＡＬａｄｄｅｒＬａｎｅ２：ｐＧＢＫＴ７．ＣＪＳａｌＩ和ＥｃｏＲＩ双酶切Ｌａｎｅ３：ｐＧＢＫＴ７－ＣＪＮｄｅＩ和ＥｃｏＲＩ双酶切ｐＧＢＫＴ７一Ｃ２－Ｎ上海博亚公司测序结果：ｃｃｑｑａａ七ｔｔｑｔａａｔａｃｑａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇｃｇａ口ａ目ｃａ口ａａ目ｃｔａａｔｃｔｃａ口ａａａａ口口ａｃｃＥａｃａＣＴＣＡＴＴＡＧＧＧＴＡＴＴＣＣＣＡＧＴＡＴＴＡＴＡＴＴＡＴＡＣ“Ｇ√ＧＡＡＧＧＣＡＧＣＴＴＣＡＧＧＡＣＴＴＣＣＴＣＡＡＴＡＡＡＴＣＡＧＡＧＧＣＴＴＡＧＧＴＣＣＴＡＴＴＡＣＡＡＡＡＴＴＣＡＧＴＣＴＴＣＧＣＣＡＣＡＡＣＣＴｅＴＣＴＴＴＧＡＡＡＴＣＡＡＧＡＡＧＣＧＴｅＣＴＣＧＣＡＡＧＣＡ一强姓％凹Ｔ一∞｛；∞∞ＴＴＧＴＡＡＧＴＧＴＴＣＡＣＡＡＴＴＣＡＴＣＡＴＧＡＡＴＧＴＡＡＴ∞蛆姐加强＂ＧＡ出ＡＧＡＧＧＡ：受凹∞＂∞”Ｃ盯∽％淞仲强ＴＣＡＣＧＣＴＡＣＡＴ盯肼他强∞∞Ａｇｏｇｇｃｃｇｃａｔａａｃｔａｇｃａｔａａｃｃｃｃｔｔｇｇｇｇｃｃｔｃｔａａａｃｇｇｇｔｃｔｔｇａｇｇｇｇｔｔｔｔｔｔｇｃｇｃｇｃｔｔｇｃａｇｃｏａ８ｇｃｔａａｔｔｃｃｇｇｇｃｇｐＧＢＫＴ７一Ｃ２一Ｃ上海博亚公司测序结果（２３０ｂｐ）：ｃｃｑｑａａｔｔｔｑｔａａｔａｃ口ａｃｔｃａｃｔａｔａ口Ⅱｑｃｑａｃｃｇｃｃａｃｃａｔｇｇｑａｑｃａｑａａｑｃｔｑａｔｃｔｃａ寸ａ町ｑａｑｑａｃｃｔｑｃａＣＣＣＡＧＧＡＣＴＴＣＴＴＣＣＧＴＴＣＣＧＧＧＣＣＡＧＴＴＴＡＴＣＡＡＣＴＧＡＡＡＧＴＣｅＡＧＡＴＡＡＧＡＴＴＣＡＡＣＣＡＣＡＡＣＣＴＣＣＧＣＡＡＡＴＡＣＴＴＧＡＡＴＣＴＴＣＡＣＡＡＧＴＧＣＴＧＧＡＴＡＧＡＴＴＴＧＡＣＧＡＴＣＡＣＴＧＧＡＴＣＧＣＡＣＡＧＧＡＣＡＴＴＡＡＣＴＧＧＧＧＡＧＡＡＡＡＡＧＡＧＡＣＴＡＧＡＧＡＴＡＴＡＣＴＴＧＧＡＴＡＡｇｔｃｇａｃｃｔｇｃａｇｃｇｇｃｃｇｃａｔａａＣｔａｇｃａ匕ａａＣＣＣＣｔｔｇｇｇｇｃｃ匕ｃｔａａａＣｇｇｇｔｃｔｔｇａｇｇｇｇｔｔｔｔｔｔｇｃｇｏｇｃｔｔｇｃａｇｃｃａ８９ｃｔａａｔｔｃｏｇｇｇｃｇａａ４８０６¨４９２０３６４７Ｏ４ｌ９６４Ｊ９２４０ＳＳ６ｌ２４２ｌｌｊｊｌ４】２４１Ｉ２２ｊｊ，￥４姜威中山大学硕士论文拟南芥Ｆｅｒｒａｄｏｘｉｎ基因与甜菜曲顶病毒（ＢＣＴＶ）作用机制的研究本实验构建了ｐＧＢＫＴ７一Ｃ２一Ｎ和ｐＧＢＫＴ７一Ｃ２一Ｃ两个酵母表达载体，构建示意图如图２—５所示。ＮｄｅＩＥｃｏＲＩＳａｌＩｌｐＧＢＫＴ７一Ｃ２（１—５２２）ｐＧＢＫＴ７－Ｃ２－Ｎ（卜２９０）ｐＧＢＫＴ７－Ｃ２一Ｃ（２９０—５２２）ｌ图２．５酵母表达载体ｐＧＢＫＴ７．Ｃ２－Ｎ和ｐＧＢＫＴ７－Ｃ２?Ｃ构建示意图２．２．３酵母表达载体ｐＧＡＤＧＨ－Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ，ｐＧＡＤＧＨ－Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ?Ｎ和ｐＧＡＤＧＨ－Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ?Ｃ的构建在验证蛋白相互作用酵母双杂交实验中，ｐＧＡＤＧＨ＋Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ的结构如图２－６所示。由于在插入位点插入的Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ基因（４４７ｂｐ）前后都有多余的序列ｔ这些序列表达的氨基酸有可能影响Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ蛋白的空间构象，因此本实验设计了Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ的５’和３’引物，用ＰＣＲ的方法获得Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ的全长，然后克隆到ｐＧＡＤＧＨ载体中，进而去除多余的序列，构建得到ｐＧＡＤＧＨ—Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ载体。（８５劬ＩＣｚｓ２５）≯一一舡∥Ｊ，酣Ｉ（４０９９）图２－６在酵母双杂交中得到的表达载体ｐＧＡＤＧＨ＋Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ