拟南芥Ferrodoxin基因与甜菜曲顶病毒(BCTV)作用机制研究(5)

姜威中山大学硕士论文拟南芥Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ基因与甜菜曲顶病毒（ＢＣＴＶ）作用机制的研究所有固体培养基都制各于９０ｘ１５ｍｍ平板。培养基高温高压蒸汽灭菌是以１２１０Ｃ１５分钟进行的。４０％葡萄糖是在培养基灭菌后冷却到６０。Ｃ加入的，加入过程保持黑暗操作。所有酵母转化所用溶液都是新鲜制备的。２．１．１．４试剂盒ＰＣＲ纯化试剂盒：“Ｖ．ｇｅｎｅ“”公司ＤＮＡ连接试剂盒：“ＭＢＩＦｅｒｍｅｎｔａｓＴＭ”公司琼脂糖凝胶ＤＮＡ回收试剂盒：“天为时代ＴＭ”公司（离心柱型ＤＰ－２０９）质粒小量提取试剂盒：“天为时代ＴＭ”公司（离心柱型ＤＰ．１０３）电泳缓冲液：ｌｘＴＢＥ缓冲液琼脂糖凝胶：１％，含有Ｏ．５ｌｋｂｐ，ｇ／ｍ｜ＥＢＤＮＡ分子量梯度标记（ＧｅｎｅＲｕｌｅｒｌ”公司）１００ｂＤＤＮＡ分子量梯度标记（ＭａｓｓＲｕｌｅｒＴＭ公司）２．１．１．５其他设备紫外无菌操作台（苏州净化设备有限公司）（苏净集团安泰公司）培养性摇床（志诚ＴＭ公司ＨＷＹ２００型，３７０Ｃ／３０。Ｃ）台式离心机（ＥｐｐｅｎｄｏｒｆＶＭ，５４１５Ｄ，５４１５Ｒ，５８１０Ｒ）ＰＣＲ仪（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈＴＭＰＴＣ一１００７“型）高压蒸汽灭菌锅（ＨＩＲＡＹＡＭＡｌＭ）纯水过滤机（ａｑｕａＭＡＸＴＭ—Ｕｌｔｒａ，Ｏ．２２Ｉ－ｔｍ过滤孔径）分光光度计（７５２紫外分光光度计）水浴锅（天力医疗器械有限公司，ＴＬ，６０００型电控多用恒温温水箱）离一Ｉ增（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ２．１．２实验方法１．５ｍｌ，２．０ｍｌ，５０ｍ１）１６姜威中山大学硕士论文拟南芥ＦｅｒｒｏｄｏＭｎ基因与甜菜曲顶病毒（ＢＣＴＶ）作用机制的研究２．１．２．ＩＰＣＲ产物的回收（１）ＰＣＲ扩增产物片段，经１．５％琼脂糖凝胶电泳后，用Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．ＧｅＬＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ试剂盒回收；ＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ：ｍｉｎ；（２）切下目的片段ＤＮＡ的凝胶加入６００９Ｌ（３）６５。Ｃ水浴ｉ０ｍｉｎ，颠倒混匀；１３０００ｒｐｍ离心１（４）加入７５０９Ｌ液体；ＤＮＡＷａｓｈｉｎｇＢｕｆｆｅｒ，１３０００ｒｐｍ离心１ｍｉｎ，除去收集管中（５）重复一次（４）；１３０００ｒｐｍ离心ｌｍｉｎ，除净Ｋｉｔ中液体：（６）将收集管换成Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管，加入５０ｕＬ无菌水，静置１０ｍｉｎ，１３０００ｒｐｍ离心ｌｍｉｎ，收集Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中溶液，一２０。Ｃ保存备用。２．１．２．２目的片段与载体的连接连接反应体系为：克隆片段，５儿：载体片段，８虬；连接缓冲液，２虬：ｄｄＨ：０，５虬：Ｔ４连接酶，０．５儿；反应总体积为，２０儿。１６。Ｃ连接过夜。２．Ｉ．２．３连接产物转化大肠杆菌取新鲜或一７０℃冰箱保存的大肠杆菌感受态细胞，冰浴解冻；“＠；ｉ加入取１０儿连接产物于Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中，轻轻混合，冰浴３０ｍｉｎ；４２℃热激９０ｓｅｃ，冰浴卜２ｍｉｎ；每管加无抗生素的ＬＢ培养基８００虬，３７。Ｃ冰浴ｌｈ：离心去上清，２００ｕＬＬＢ重悬沉淀；涂板，将２００儿菌液涂布于含Ｋａｎ的平板表面；３７。Ｃ培养过夜。＠ｑ∞∞ｏ）姜威中山大学硕士论文拟南芥Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ基因与甜菜曲顶病毒（ＢＣＴＶ）作用机制的研究２．１．２．４大肠杆菌转化子的鉴定大肠杆菌转化子质粒提取（采用Ｅ．ｚ．Ｎ。Ａ．Ｐｌａｓｍｉｄ试剂盒）（１）单菌落接种于含５０ｕｇ／ｍｌＫａｎ５ｍＬＭｉｎｉｐｒｅｐｓＫｉｔＩＬＢ摇瓶中，３７。Ｃ震荡过夜培养，ｒａｉｎ；（２）收集１．５ｍＬ的培养物入Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中，１３０００ｒｐｍ离心１（３）加入２５０ｐＬＳｏｌｕｔｉｏｎＩ，弃上清，室温干燥细菌沉淀；（４）ＲＮａｓｅＡ，剧烈震荡，充分混匀；（５）加入２５０ｌａ液；（６）加入３５０ｐＬＬＳｏｌｕｔｉｏｎＩＩ，颠倒混匀，室温静置１０ｍｉｎ，得丝装裂解Ｓｏｌｕｔｉｏｎ［ＩＩ，轻轻混匀，室温静置１０ｍｉｎ至白色沉淀；ＤＮＡ（７）１３０００ｒｐｍ离心１０—１５ｍｉｎ，移上清至ＨｉＢｉｎｄ上２ⅢＬ的收集管；（８）３０００ｒｐｍ离心Ｉｍｉｎ：弃收集管内的废液：（９）加５００ｕＬＣｏｌｕｍｎ回收柱内，套Ｂｕｆｆｅｒ耶至回收柱，１３０００ｒｐｍ离心ｌｍｉｎ洗柱，弃废液；ＬＷａｓｈｉｎｇ（１０）加７５０ｕＢｕｆｆｅｒ至回收柱，１３０００ｒｐｍ离心ｌｍｉｎ洗柱，弃废液；（１１）重复（１０）步：（１２）将回收柱进行１３０００ｒｐｍ离心ｌｍｉｎ；（１３）加５０一１００ｕＬ去离子水，室温静置３０ｍｉｎ，洗脱柱上的ＤＮＡ；（１４）将收集管换成Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中，套上回收柱；（１５）１３０００ｒｐｍ离心ｌｍｉｎ收集质粒ＤＮＡ：一２０℃保存。２．１．２．５验证蛋白相互作用酵母双杂交实验：（１）ＹＰＤ平板上２８。Ｃ培养ＨＦＴｃ酵母细胞三天。１８姜威中山大学硕士论文拟南芥Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ基因与甜菜曲顶病毒（ＢＣＴＶ）作用机制的研究（２）取ＹＰＤ平板上２－３个ＨＦ７ｃ酵母细胞菌落克隆，接种到１０ｍｌＹＰＤ液体培养基。２８。Ｃ预培养１０个小时。测该预培养的ＯＤ６００值。（测得预培养的ＯＤ６００值：Ｏ．２１４）（３）把４５ｕ１、９０ｕｌ、１８０１１ｌ预培养的ＨＦ７ｃ菌液分别转移到５０ｍｌＹＰＤ液体培养基。２８。Ｃ摇床（２００ｒｐｍ）正式培养过夜。所转移的预培养菌液的体积由下列公式计算：ＯＤ６００Ｖｐｒｅｉｎｏｃ２×ＶｉｎｏｃｏＯＤＤｒｅｉｎｏ×２ＯＤ６００是指正式培养所预期达到的ＯＤ６００值（分别设定为０．２、０．４、０．８）。ＯＤ。Ⅻ。是指预培养达到的ＯＤ６００值（０．２１４）。Ｖ㈣是指正式培养的液体培养基的体积（５０ｍ１）。ｎ是正式培养所用时间菌体生长的世代数（１．５小时一个世代，正式培养１５小时则有ｌＯ个世代）。（４）测正式培养的ＯＤ６００值。如果ＯＤ６００值达到预期的数值（０．３～Ｏ．８）。实际实验需时１８个小时。取３０１１１ｌ菌液到５０ｍ１离心管，室温下４０００ｒｐｍ离一ｔＬ，５分钟。（５）用菌液一半体积的无菌水（１５ｍ１）洗沉淀的菌团，室温下４０００ｒｐｍ离心５分钟。（６）用６ｍｌＯ．１ＭＬｉＯＡｃ，ｑ＇Ｅ溶液洗沉淀的菌团，室温下４０００ｒｐｍ离心５分钟。（７）用０．Ｏｌ体积（Ｏ．３ｍ１）的Ｏ．ＩＭＬｉＯＡｃ／ＴＥ溶液重悬菌团细胞，２８。Ｃ（１００ｒｐｍ）摇３０分钟。（８）把１０ｍｇ／ｍｌ的ｓａｌｍｏｎＤＮＡ１００ｕｏＣ加热５分钟变性。准备５个灭过菌的离心管，编号为１．５。每个离心管加入５ｌ的ｓａｌｍｏｎＤＮＡ。另外向每个离心管加入不１９姜威中山大学硕士论文拟南芥Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ基因与甜菜曲顶病毒（ＢＣＴＶ）作用机制的研究同的两种质粒，加入质粒的组合和量如下表所示，其中每种质粒的加入量都为２９９：（９）往１．５离心管各加入１００ｐｌ经过第（１）～（７）步培养处理后的ＨＦ７ｃ感受态细胞。用枪头吸注数次以混匀。２８０Ｃ（１００ｒｐｍ）摇３０分钟。（１０）６００分钟。ｕ１４０％ＰＥＧ（４０％ＰＥＧ０．１ＭＬｉＯＡｃ／ＴＥ），混匀，２８。（２（１００ｒｐｍ）摇４５（１１）加入１５０ｕ１ＤＭＳＯ，使得终浓度为１０％，混匀，接着４２ｏｃ热击１０分钟。（１２）室温下４０００ｒｐｍ离心３分钟。用２００Ｉ．ｔｌ无菌水洗沉淀的菌团，室温放置ｌＯｕ分钟。每个筛选性平板（ＣＭ?Ｌｅｕ—Ｔｒｐ，ＣＭ－Ｌｅｕ—Ｔｒｐ—Ｈｉｓ）用１００涂布。３０℃培养３天。Ｉ已转化的细胞２．１．２．６确定蛋白发生相互作用具体结构域酵母双杂交实验（１）ＹＰＤ平板上２８０Ｃ培养ＨＦ７ｃ酵母细胞三天。（２）取ＹＰＤ平板上２～３个ＨＦ７ｃ酵母细胞菌落克隆，接种到１０ｍｌＹＰＤ液体培养基。２８０Ｃ预培养１０个小时。测该预培养的ＯＤ６００值。０．２１４）（测得预培养的ＯＤ６００值：