拟南芥Ferrodoxin基因与甜菜曲顶病毒(BCTV)作用机制研究(2)

姜威中山大学硕士论文拟南芥Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ基因与甜菜曲顶病毒（ＢＣＴＶ）作用机制的研究第一章：前言１．１文献综述１．１．１双生病毒研究进展双生病毒（Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓ）是一组具有双生颗粒形态的单链环状ＤＮＡ植物病毒（ＬａｚａｒｏｗｉｔｚＳＧ．．１９９２；ＴｉｍｍｅｒｍａｎｓＭＣ．ｅｔａ１．，１９９４；ＤｈａｒＡＫ．，ｅｔａｌ，１９９５）。典型的双生病毒为１８×３０ｎｍ颗粒，基因组大小为２．５～３．０ｋｎｔ。双生病毒研究已成为植物病毒学最活跃的领域之一。双生病毒的介体传播在自然界中以昆虫为介体为多。饲毒所需时间、潜伏期、在介体中的存留和接种传毒所需时间依不同的病毒和介体而不同。病毒在介体中不增殖，虫卵不带毒。其传毒效率常依赖于饲毒时期和植物中的病毒浓度。双生病毒的传播首先涉及病毒粒子进入昆虫肠道、再进入昆虫的循环系统（体腔）、然后进入唾液腺，最终通过唾液腺进入植物。粉虱传毒的专一性决定于体腔一唾液腺屏障（ＣｏｈｅｎＳＪ．，ｅｔａｌ，１９８９）。病毒一昆虫相互作用的特异性由昆虫和病毒两方面决定，例如叶蝉，主要由一个与性连锁的显性基因控￥１ｊ（ＭｕｒｐｈｙＦＡ．，ｅｔａｌ，１９９５）；在病毒方面，似乎由病毒的外壳蛋白决定，用甜菜曲顶病毒的外壳蛋白基因代替非洲木薯花叶病毒的外壳蛋白基因构建的嵌合病毒，胄＆被甜菜曲顶病毒的介体叶蝉传播，表明外壳蛋白与昆虫介体直接相关（ＢｆｉｄｄｏｎＲＷ．，ｅｔａｌ，１９９０）。依据基因组结构和介体，双生病毒被划分为三个亚组，亚组Ｉ，亚组ＩＩ和亚组ⅡＩ。亚组Ｉ至少有１０个成员，基因组为单组份，大小为２．６～２．８ｋｎｔ。亚组ＩＩ双生病毒基因组为单组份。大小为２．７～３．０ｋｎｔ，该亚组病毒的寄主均为双子叶植物。甜菜曲顶病毒是其代表病毒。除番茄假曲顶病毒为树蝉传播外，该亚组病毒均为叶蝉传播。亚组ⅡＩ为粉虱传播的双生病毒，该亚组至少有３０个成员。该亚组病毒仅侵染姜威中山大学硕士论文拟南芥Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ基因与甜菜曲顶病毒（ＢＣＴＶ）作用机制的研究双子叶植物。在自然界，亚组ＩＩＩ的双生病毒通过粉虱以持久性方式传播。大多亚组ＩⅡ双生病毒的基因组为双组份，大小为２．５－－２．８ｋｎｔ。根据基因组结构，昆虫介体和寄主范围的不同，双生病毒科（Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｉｄａｅ）被划分为４个属，即玉米线条病毒属（Ｍａｓｔｒｅｖｉｒｕｓ）、菜虫金黄叶病毒属（Ｂｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓ）、曲顶病毒属（Ｃｕｒｔｏｖｉｒｕｓ）和伪曲项病毒属（Ｔｏｐｏｃｕｖｉｒｕｓ）（ＦａｕｑｕｅｔＣＭ．，ｅｔａｌ，２００３）。在自然条件下，Ｂｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓｅｓ侵染双子叶植物，全部由烟粉虱（Ｂｅｍｉｓ妇ｔａｂａｃｉ）传播，因此也称作粉虱传双生病毒（ｗｈｉｔｅｆｌｙ．ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓｅｓ．ＷＴＧ）（ＨａｒｒｉｓｏｎＢＤ．，ｅｔａｌ，１９９９）。大多菜虫金黄叶病毒属包含２个大小相近的单链环状ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）组份，称ＤＮＡ．Ａ和ＤＮＡ．Ｂ。ＤＮＡ．Ａ与病毒的复制和介体传播有关：ＤＮＡ—Ｂ编码核穿梭蛋白和运动蛋白，与病毒在植物体内的运输和病毒的寄主范围有关（Ｈａｒｒｉｓｏｎａｌ，１９９９；Ｈａｎｌｅｙ．ＢｏｗｄｏｉｎＬ．，ｅｔＹｉｎＢＤ．．ｅｔａｌ，１９９９）。番茄黄化曲叶病毒（ＭｏｄｏｎｅｓＩＢ．，ｅｔＥ．，ｅｔａｌ，２００１ＱＹ．，ｅｔａｌ，２００１）、番茄曲叶病毒（Ｄｒｙａｌ，１９９７）、木尔坦棉花曲叶病毒（ＢｄｄｄｏｎＲＷ．ｅｔａｌ，２００１）和胜红蓟黄脉病毒（ＳａｕｎｄｅｒｓＫ．，ｅｔａｌ，２０００）等，被鉴定为单组份双生病毒，即仅有ＤＮＡ—Ａ。双生病毒在全球范围内的发生日益猖獗，“Ｓｃｉｅｎｃｅ”１９９９年１２月３日曾以ＡＳ．，“双生病毒正在成为作物的严重威胁”为标题专门报道了这类病毒（Ｍｏｆｆａｔ１９９９）。目前，已在非洲木薯，巴基斯坦棉花，墨西哥辣椒及美洲、西班牙和意大利番茄等作物上发现了双生病毒的重组现象，特别是种间重组发生频率高，且往往会导致双生病毒基因组的多样性并产生新的病毒或株系（ＰａｄｉｄａｍＭ．，ｅｔａｌ，２００１）。由于双生病毒对农作物危害极大，因此有必要研究病毒与植物相互作用的分子机理，以便寻找植物抗病的分子途径。自２０世纪９０年代起，在我国的广西、云南、海南和台湾等地也相继发现烟草、番茄、南瓜和番木瓜等多种作物遭受双生病毒危害（洪益国等，１９９４：刘玉乐等，１９９８；谢艳等，２００ｌ；ＺｈｏｕＸＰ．，ｅｔａｌ，２００１ａ；ＺｈｏｕＸＰ．，ｅｔａｌ，２００１ｂ）。双生病毒侵染范围广泛，严重影响植物的正常生长，对农业生产造成巨大的危害。甜菜曲顶病毒（Ｂｅｅｔｃｌｌｒｔｙｔｏｐｖｉｒｕｓ，ＢＣＴＶ）是双生病毒的一种。研究双生病毒的复制和植物细胞的关系有助于揭示寄主植物与病毒相互作用方式，进而为防治２姜威中山大学硕士论文拟南芥Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ基因与甜菜曲顶病毒（ＢＣＴＶ）作用机制的研究由双生病毒引起的植物病害奠定基础。ＢＣＴＶ是双生病毒ＩＩ亚组的成员之一，这个病毒能够感染许多双子叶植物宿主，ＢＣＴＶ基因组包含７个保守的开放性读码框（ＳｈｅｒｉａｒＧ．ｅｔａ１．１９９５）。Ｃ２蛋白是ＢＣＴＶ的一个非常重要的蛋白，Ｃ２蛋白能够和细胞转录蛋白发生作用，进而激活病毒基因的表达（Ｌ糊ｏｗｉｍ，Ｓ．ｅｔａ１．１９９２）。Ｃ２蛋白能够和单链ＤＮＡ也能够和双链ＤＮＡ发生结合。有实验为了研究Ｃ２蛋白的功能，对Ｃ２蛋白的开放性读码框进行了突变，结果显示Ｃ２的突变体能够增强植物的恢复。这一实验的原理还在研究中（ＳｈｅｒｉａｒＧ．ｅｔａ１．，１９９５）。１．１．２铁氧还蛋白基因（Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ）概况Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ基因全长４４７ｂｐ，能够编码１４９个氨基酸。Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ蛋白是一种含铁硫的低分子量非血红素蛋白质，它具有低还原电位，在光合作用及固氮作用中起早期电子接纳体作用。目前围绕Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ进行研究的文章不多。Ｖｏｒｓｔ，Ｏ．等的Ｓｏｕｔｈｅｍ实验表明在拟南芥中Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ基因只有一个拷贝。Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ是受光的正调控的蛋白。无论是对黑暗还是对光照，Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ的响应时间都是非常快的。Ｖｏｒｓｔ．Ｏ．等把Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ基因转化入烟草中，实验表明Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ的表达量在叶子中要高于根中（Ｖｏｒｓｔ…０ｅｔａｌ，１９９０）。Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ基因的启动子含有两个保守的序列，分别是ＡｃＧｃｃＡｃＧｌ’ＧＧＴＡＧＡＴＡＧＧＡＴＴ（Ｇ．Ｉｂｏｘ）和ＣＣＡＣＧＣｃＡｒ兀＇ＣｃＡＣＡＡＧＣ（ＣＣＡＣｂｏｘ），这两段序列在拟南芥中是十分保守的（Ｓｏｍｅｒｓ，Ｄ．ｅｔａｌ，１９９０）。相比较于其他绿色植物的Ｆｅｒｒｏｄｉｘｎ基因，欧芥（Ｐａｒｓｌｅｙ）的Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ蛋白与小麦中的Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ蛋白具有更大的同源性（ＮａｋａｎｏＴ．ｅｔａｌ，１９８１）。１．１．３酵母双杂交系统研究进展酵母双杂交体系简称双杂交体系（ｔｗｏ—ｈｙｂｒｉｄｓｙｓｔｅｍ），又称相互作用陷阱（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｔｒａｐ），是１９８９年由Ｆｉｅｌｄｓ和Ｓｏｎｇ（１９８９）提出并初步建立的。这一系统是３姜威中山大学硕士论文拟南芥Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ基因与甜菜曲项病毒（ＢＣＴＶ）作用机制的研究在酿酒酵母中研究蛋白质问相互作用的一种非常有效的分子生物学方法。上个世纪九十年代初期发展成为一种灵敏的真核细胞内鉴定基因的方法，可有效地用来分离能与一种己知的靶蛋白相互作用的蛋白质的编码基因（王关林等，２００２）。此技术以其简便、灵敏、高效以及能反映不同蛋白质之间在活细胞内的相互作用等特点得到广泛应用（张迪等，２０００）。酵母双杂交系统也可应用于确定两个已知有生理作用的蛋白间的作用位点或结构域。此外还应用于绘制蛋白质联系图谱，药物设计等许多方面（ＦｉｅｌｄｓＳ．，ｅｔａｌ，１９９４）。酵母双杂交系统是利用真核生物（酿酒酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅ＃ｅｖｄｓｉａｅ）的转录调控蛋白ＧＡＬ４的特性建立的。ＧＡＬ４蛋白是编码半乳糖代谢酶的基因的转录激活子。ＧＡＬ４蛋白由两个相互独立的功能性结构域构成，分别是Ｎ一端的ＤＮＡ结合结构域（ＤＮＡｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎ，简称为ＢＤ）和ｃ一端的转录激活结构域（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｄｏｍａｉｎ，简称为ＡＤ）。Ｆｉｅｌｄｓ和Ｓｏｎｇ以与ＳＵＣ２基因调控有关的两个已知有相互作用的蛋白质ＳＮＦＩ和ＳＮＦ４为模型，将前者与Ｇａｌ４的ＢＤ结构域融合，另外一个与Ｇａｌ４的ＡＤ结构域的酸性区域融合。由ＢＤ和ＡＤ形成的融合蛋白现在一般分别称ｏｒ之为“诱饵”（ｂａｉｔ）和“猎物”或靶蛋白（ｐｒｅｙｔａｒｇｅｔｐｒｏｔｅｉｎ）。如果在ＳＮＦｌ和ＳＮＦ４之间存在相互作用，那么分别位于这两个融合蛋白上的ＢＤ和ＡＤ就能重新形成有活性的转录激活因子，从而激活相应基因的转录与表达。这个被激活的、能显示“诱饵”和“猎物”相互作用的基因称之为报告基因（ｒｅｐｏｒｔｅｒｇｅｎｅ）。通过对报告基因表达产物的检测，反过来可判别作为“诱饵”和“猎物”的两个蛋白质之间是否存在相互作用。采用编码１３一半乳糖苷酶的ＬａｃＺ作为报告基因，并且在该基因的上游调控区引入受Ｇａｌ４蛋白调控的ＧＡＬｌ序列。这个改造过的ＬａｃＺ基因被整合到酵母染色体ＵＲＡ３位上。而酵母的６ＡＬ４基因和６ＡＬ８０基因（ＣａｌＳＯ是Ｇａｌ４的负调控因子）被缺失，从而排除了细胞内源调控因子的影响。因为已经知道在ＳＮＦｌ和ＳＮＦ４之间存在相互作用，结果发现只有同时转化了ＳＮＦＩ和ＳＮＦ４融合表达载体的酵母细胞才有１３一半乳糖苷酶活性，单独转化其中任何一个载体都不能检测出口一半乳糖苷酶活性（ＦｉｅｌｄｓＳ．，ｅｔａｌ，１９９４）。目前发展起来的各种双杂交系统大多是以Ｆｉｅｌｄｓ等人建立的系统为基础的。这些新系统主要对报告基因、“诱饵”表达载体以及“猎物”表达载体等做了一些４姜威中山大学硕士论文拟南芥Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ基因与甜菜曲顶病毒（ＢＣＴＶ）作用机制的研究改进。因。其中一个重要改进是引入额外的报告基因，如广泛采用的ＨＩＳ３和厶ｃｚ基这些改造后的基因在启动子区有相同的转录激活因子结合位点，因此可以被相同的转录激活因子（如上述的Ｇａｌ４蛋白）激活。通过这种双重或多重选择既提高了检测灵敏度又减少了假阳性现象（杨齐衡等，ｄｏｍａｉｎ基因有：１９９９）。目前研究中常用ｂｉｎｄｉｎｇ—刷三４（卜１４７）：ＬｅｘＡ（Ｅｃｏｌｉ转录抑制因子）的ＤＮＡ—ｂｄ编码序列。常用的ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ－ｄｏｍａｉｎ基因有：ＧＡＬ４（７６８—８８１）和疱疹病毒ＶＰｌ６的编码序列等（ＳａｄｏｗｓｋｉＩ．，ｅｔａｌ．１９８８）。用酵母双杂交体系研究植物主要集中于模式植物拟南芥，也偶有用于研究烟草、矮牵牛和菠菜的报道。随着双杂交系统的完善，人们开始用此技术筛选克隆与光敏色素相互作用的蛋白质。美国Ｑｕａｉｌ实验室的Ｎｉ等（１９９９）首先以光敏色素Ｃ末端序列为诱饵，从拟南芥的ｅＤＮＡ文库中筛选到一个与光敏色素发生相互作用的蛋白ＰＩＦ３，是一个转录因子。马力耕和孙大业（２００１）也克隆到一种体内与光敏色素相互作用的转录因子，并证实被光活化的光敏色素可直接进入细胞核与转录因子结合启动基因表达。Ｆａｎｋｈａｕｓｅｒ等（１９９９）和Ｃｈｏｉ等（１９９９）用同样的方法，分别检测到另外两种与光敏色素相互作用的蛋白：ＰＳＫｌ和ＮＤＰＫ２。１．１．４基因干扰技术（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ＲＮＡｉ）研究进展１９９０年，ＲｉｃｈＪｏｒｇｅｎｓｅｎ等人对矮牵牛（Ｐｅｔｕｎｉａｓ）进行了研究，尝试加深花朵的颜色。他们将一个能产生色素（ｃｈａｌｃｏｎｅｓｙｎｔｈａｓｅ）的基因前加上一个强的启动子后，转入矮牵牛中，结果没有看到期待的深紫色花朵，多数花朵成了花斑色甚至白色。因为导入的基因和其内源基因同时都被抑制，所以Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ将这种现象命名为协同抑制“ｃｏ—ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ”。开始认为这种现象是矮牵牛特有，后来发现在其他许多植物，甚至在真菌中也有类似情况。ＲＮＡ酶ＩＩＩ是一种能切割双链ＲＮＡ的酶，参与ＲＮＡｉ反应的Ｄｉｃｅｒ酶是ＲＮＡ酶ＩＩＩ家族的一个成员。Ｄｉｃｅｒ酶广泛存在于蠕虫，果蝇，真菌，植物及哺乳动物体内。它的结构中包括一个螺旋酶结构域，两个ＲＮＡ酶ＩＩＩ结构域，一个双链ＲＮＡ结合位点。在Ｄｉｃｅｒ酶的作用下，双链ＲＮＡ被裂解成２ｌ到２３个核苷酸的片断，５