拟南芥Ferrodoxin基因与甜菜曲顶病毒(BCTV)作用机制研究(3)

姜威中山大学硕士论文拟南芥Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ基因与甜菜曲顶病毒（ＢＣＴＶ）作用机制的研究称为ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ的ＲＮＡｉ反应。ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅＲＮＡ）（ＢｅｒｎｓｔｅｉｎＥ．ｅｔａ１．２００１），它启动了细胞内双链ＲＮＡ进入细胞后，一方面在Ｄｉｃｅｒ酶的作用下被裂解成ｓｉＲＮＡ，另一方面在ＲｄＲＰ的作用下自身扩增后，再被Ｄｉｃｅｒ酶裂解成ｓｉＲＮＡ。ＳｉＲＮＡ的双链解开变成单链，并和某些蛋白形成复合物，Ａｒｇｏｎａｕｔｅ２是目前唯一己知的参与复合物形成的蛋白（Ｈａｍｍｏｎｄ，Ｓ．ｅｔａ１．２００１）。此复合物同与ｓｉＲＮＡ互补的ｍＲＮＡ结合，一方面使ｍＲＮＡ被ＲＮＡ酶裂解，另一方面以ＳｉＲＮＡ作为引物，以ｍＲＮＡ为模板，在ＲｄＲＰ作用下合成出ｍＲＮＡ的互补链（ＳｉｊｅｎＴ．ｅｔａ１．２００ｌ；ＬｉｐａｒｄｉＣ．ｅｔａ１．２００１）。结果ｍＲＮＡ也变成了双链ＲＮＡ，它在Ｄｉｃｅｒ酶的作用下也被裂解成ｓｉＲＮＡ。这些新生成的ｓｉＲＮＡ也具有诱发ＲＮＡｉ的作用，通过这个聚合酶链式反应，细胞内的ｓｉＲＮＡ大大增加，显著增加了对基因表达的抑制。从２ｌ到２３个核苷酸的ｓｉＲＮＡ到几百个核苷酸的双链ＲＮＡ都能诱发ＲＮＡｉ，但长的双链ＲＮＡ阻断基因表达的效果明显强于短的双链ＲＮＡ。在小鼠的胚胎细胞中也存在ＲＮＡｉ，将７２７个碱基对的双链ＲＮＡ转入小鼠的畸胎瘤细胞，诱发了细胞内的ＲＮＡｉ机制，并抑制了报告基因的表达（Ｂｉｌｌｙ２００１）。Ｅ．ｅｔａ１．根据一条ｍＲＮＡ的不同靶位点可以合成出许多条双链ＲＮＡ，研究发现这些双链ＲＮＡ的作用差别很大（ＨｏｌｅｎＴ．ｅｔａ１．２００２）。ＧＣ含量低的区域似乎双链ＲＮＡ的效果好。线虫内的ｓｉＲＮＡ可以作为引物，以靶ｍＲＮＡ为模板，在ＲＤＲＰ及Ｄｉｃｅｒ的作用下，大量扩增ｓｉＲＮＡ。将ｓｉＲＮＡ的３’末端标记上ＦＩＴＣ使它丧失引物的作用，在将其转入哺乳动物细胞内，它抑制靶基因的作用并没有受到影响。因而研究者推测，哺乳动物细胞内不存在象线虫那样的依赖于ＲＤＲＰ的ＲＮＡｉ放大机制。在哺乳动物细胞中瞬时转染ｄｓＲＮＡ后，ｄｓＲＮＡ的作用只维持了三天。而将表达ｄｓＲＮＡ的载体转入哺乳动物细胞后筛选出的稳定表达株中，在转染八周后ｄｓＲＮＡ仍能有效的抑制靶基因的表达（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ．Ｔ．Ｒ．ｅｔａ１．２００２）。利用载体表达山的ｄｓＲＮＡ为发夹结构，其环状部位的核苷酸的序列和数目对ｄｓＲＮＡ的作用都有影响，研究者发现９个核苷酸比５个或７个核苷酸的效果好。ｄｓＲＮＡ的作用很强，在ｌｎＭ时就能有效的阻断靶基因的表达。ＲＮＡｉ还具有很高的特异性。１９个核苷６姜威中山大学硕士论文拟南芥Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ基因与甜菜曲顶病毒（ＢＣＴＶ）作用机制的研究酸的ｄｓＲＮＡ几乎可以完全抑制基因的表达，而将其中的一个核苷酸突变掉后，它对基因的抑制作用就消失了（ＳｕｉＧＨ．ｅｔａ１．２００２），这对ｄｓＲＮＡ的应用是非常重要的，这可以避免ｄｓＲＮＡ降解与靶ｍＲＮＡ同家族的其他的ｍＲＮＡ。双链ＲＮＡ只能短暂抑制哺乳动物细胞的基因表达。而具有发卡结构的双链ＲＮＡ能够增加阻断基因表达的时间。在小鼠畸胎瘤细胞，胚胎干细胞，Ｃ２Ｃ１２细胞中，用长链具有发卡结构的双链ＲＮＡ有效的阻断了报告基因的表达，在稳定表达具有发卡结构的双链ＲＮＡ的细胞株中，报告基因的表达被长期的阻断了（ＰａｄｄｉｓｏｎＰＪ．Ｅｔａ１．２００２）。７姜威中山大学硕士论文拟南芥Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ基因与甜菜曲顶病毒（ＢＣＴＶ）作用机制的研究１．２本研究的目的内容和技术方案双生病毒侵染范围广泛，严重影响植物的正常生长，对农业生产造成巨大的危害。甜菜曲顶病毒是双生病毒的一种。研究双生病毒的复制和植物细胞的关系有助于揭示寄主植物与病毒相互作用方式，进而为防治由双生病毒引起的植物病害奠定基础。本论文的研究内容：利用酵母双杂交系统确定和甜菜曲顶病毒（ＢＣＴＶ）中Ｃ２蛋白发生相互作用的三个蛋白：Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ，ＡＰ２，ＳＡＭＤＣ设计合适的引物，应用ＰＣＲ技术扩增Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ基因构建ｐＧＡＤＧＨ—Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ表达载体构建ｐＧＡＤＧＨ．Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ—Ｎ。ｐＧＡＤＧＨ—Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ—Ｃ表达载体构建ｐＢＡ００２一Ｆｅｒｄｄｏｘｉｎ表达载体构建ｐＳＫＩＮＴ．ｓｅｎｓｅ．ａｎｔｉｓｅｎｓｅ载体构建ｐＥＲ８一ＦｅｒｒｏｄｉｘｎＲＮＡｉ表达载体构建ｐＧＢＫＴ７一Ｃ２一Ｎ，ｐＧＢＫＴ７一Ｃ２一Ｃ表达载体用农杆菌介导法转化ｐＢＡ００２．Ｆｅｒｒｉｄｏｘｉｎ表达载体和ｐＥＲ８一ＦｅｒｒｏｄｏｘｉＲＮＡｉ表达载体进入拟南芥１０．在抗性平板上筛选转基因植物１１．Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ检测Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ在高表达拟南芥中的表达量１２．转基因植物的表型分析１３．甜菜眭珏顶病毒感染高表达转基因拟南芥１４．酵母表达载体共转化酵母，确定蛋白发生作用的结构域８姜威中山大学硕士论文拟南芥Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ基因与甜菜曲顶病毒（ＢＣＴＶ）作用机制的研究本实验技术路线图．１：９姜威中山大学硕士论文拟南芥Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ基因与甜菜曲顶病毒（ＢＣＴＶ）作用机制的研究本实验技术路线图．２：１０