拟南芥Ferrodoxin基因与甜菜曲顶病毒(BCTV)作用机制研究(6)

姜威中ＩＩｌ大学硕士论文拟南芥Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ摹因与甜菜曲顶病毒（ＢＣＴＶ）作用机制的研究（３）把４５ｕｌ、９０ｕｌ、１８０ｕｌ预培养的ＨＦ７ｃ菌液分别转移到５０ｍｌＹＰＤ液体培养基。２８。Ｃ摇床（２００ｒｐｍ）正式培养过夜。所转移的预培养菌液的体积由下列公式计算：ＯＤ６００Ｖｐｒｅｉｎｏｃ＝ＯＤＤｒｅｉｎｏ×２ｏ×ＶｉｎｏｃＯＤ６００是指正式培养所预期达到的ＯＤ６００值（分别设定为Ｏ．２、０．４、Ｏ＿８）。ＯＤ。ｉ。是指预培养达到的ＯＤ６００值（Ｏ．２１４）。ｖ。。。是指正式培养的液体培养基的体积（５０ｍ１）。ｎ是正式培养所用时间菌体生长的世代数（１．５小时一个世代，正式培养１５小时，则有１０个世代）。（４）测正式培养的ＯＤ６００值。如果ＯＤ６００值达到预期的数值（０．３～Ｏ．８）。实际实验需时１８个小时。取３０ｍｌ菌液到５０ｍｌ离心管，室温下４０００ｒｐｍ离心５分钟。（５）用菌液一半体积的无菌水（１５ｍＩ）洗沉淀的菌团，室温下４０００ｒｐｍ离心５分钟。（６）用６ｍｌＯ．ＩＭＬｉＯＡｃ／ＴＥ溶液洗沉淀的菌团，室温下４０００ｒｐｍ离心５分钟。（７）用Ｏ．０１体积（Ｏ．３ｍ１）的Ｏ．１ＭＬｉＯＡｃ／ＴＥ溶液重悬菌团细胞，２８。Ｃ（１００ｒｐｍ）摇３０分钟。（８）把１０ｍｇ／ｍｌ的ｓａｌｍｏｎＤＮＡ１００。Ｃ加热５分钟变性。准备１３个灭过菌的离心管，编号为ｌ—１３。每个离心管加入５“Ｉ的ｓａｌｍｏｎＤＮＡ。另外向每个离心管加入不同的两种质粒，加入质粒的组合和量如下表所示，其中每种质粒的加入量都为２９９：２ｌ姜威中山大学硕士论文拟南芥Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ基因与甜菜曲顶病毒（ＢＣＴＶ）作用机制的研究（９）往ｌ—１３离心管各加入１００ｕ１经过第（１卜（７）步培养处理后的ＨＦ７ｃ感受态细胞。用枪头吸注数次以混匀。２８。Ｃ（１００ｒｐｍ）摇３０分钟。（１０）６００ｕ１４０％ＰＥＧ（４０％ＰＥＧＯ．１ＭＬｉＯＡｃ／ＴＥ），混匀，２８。Ｃ（１００ｒｐｍ）摇４５分钟。（１１）加入１５０ｕ１ＤＭＳＯ，使得终浓度为１０％，混匀，接着４２。ｃ热击１０分钟。（１２）室温下４０００ｒｐｍ离心３分钟。用２００ｕｌ无菌水洗沉淀的菌团，室温放置ｌＯ分钟。每个筛选性平板（ＣＭ—Ｌｅｕ—Ｔｒｐ，ＣＭ—Ｌｅｕ—Ｔｒｐ—Ｈｉｓ）用１００涂布。３００Ｃ培养３天。ｕ１已转化的细胞２．１．２．７Ｘ－ｇａｌ实验：（１）挑取ＣＭ—Ｌｅｕ—Ｔｒｐ—Ｈｉｓ筛选性平板上的菌落，接种到５ｍｌＣＭ—Ｌｅｕ．Ｔｒｐ－Ｈｉｓ液体培养基２００ｒｐｍ２８。Ｃ培养过夜。姜威中山大学硕士论文拟南芥Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ基因与甜菜曲顶病毒（ＢＣＴＶ）作用机制的研究（２）把第（１）步培养的酵母菌液进行Ｘ—ｇａｌ分析，初步筛选出“真阳性”（显蓝色）克隆。①把第（１）步的菌液４０００ｒｐｍ离心５分钟，用约４ｍｌ无菌水重悬，取２９ｌ点滴到９０ｘ１５ｍｍ平板内一张Ｗｈａｔｍａｎ５５ｍｍ滤纸上，其余重悬的菌液用作第（４）步的质粒提取。然后把滤纸放入液氮３０秒使之湿润固定。②用含有２ｍｇ／ｍｌＸ－ｇａｌ的ｚ缓冲液浸润另一张滤纸，作为“背景滤纸”。把点有克隆菌液的滤纸置于“背景滤纸”上，放于９０ｘ１５ｍｍ平板中。③把盛有两张滤纸的平板于３０。Ｃ培养３０分钟以上，观察克隆颜色的变化，并拍照。姜威中山大学硕士论文拟南芥Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ基因与甜菜曲项病毒（ＢＣＴＶ）作用机制的研究２．２实验结果与分析２．２．１验证蛋白相互作用酵母双杂交实验结果表２．１显示共转化酵母在ＣＭ—Ｌｅｕ—Ｔｒｐ和ＣＭ—Ｌｅｕ—Ｔｒｐ—Ｈｉｓ平板上生长情况以及进行ｘ—ｇａｌ检测结果，实验结果表明，在酵母双杂交体系中，ｃ２蛋白是能够分别和Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ蛋白，ＡＰ２蛋白以及ＳＡＭＤＣ蛋白发生相互作用的。表２－１验证蛋白相互作用酵母双杂交实验结果ＡＰ２基因（ＡｔｌＧ５３９１０）序列（１０７７ｂｐ）：ＴＧ＾ＣＧＴＴＣＧＴＣＴＴ＾ＣＴ０ＴＡＧＧ＾Ｇ＾０ＣＴＴＣＣＴＴ＾＾ＣＴＧＴＴＧＧ＾ＡＣＴＡＡＡＧＣＴＧ＾０ＴＣＧＴＴＣＧＴＣＡＡ＾ＡＣＴＣＡＱＣＧＴＧ＾０ＡＡ＾ＣＧＣＣＣＡＴＴＣ＾Ｔ０Ｇ＾Ｃ０ＣＴＧＣＴＴＴＣ＾Ｔ＾ＴＴＴ＾＾０ＣＡＡＧＰ＇ＴＣＣＣＧＧＣＴＡＣＧＡＴＧＡＡＯＣＴＴＣＴ＾ＯＴＡＴＧＡＣＡＣ＾ＧＣＣＯＣＴＧ０＾ＧＧＡＡＡＱＴＴＣＣＴＧＧＣＢＴＴＴＣＧＴＴＯＴＣＢＡＴ０ＧＧ＾０Ｇ８ＣＴ０ＴＯＡ＾ＧＢＣＴＧＡＧＴＣＣＡＯＴＡＣＴＴＴＴＣＣＴＧＴＴＣＴＴＴ＾ＴＴＣＴＧＴＴＣＧ＾ＴＯＡＴ０ＣＴＧＣＴＣＣＡＡ＾ＧＴＴＣＴＣＧＧＴＧＧＣＧＧＡＧＣＯＴ＾０＾ＯＡＴＧＡ＾ＣＡＱ＾ＡＣＯＴＧＯＯＡＧＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＴＣＡＧＴＣＣＣＣＯＡＡＧＧＡＴＴＣＴＡＡＡＧＡＡＡＡＡＣＣＴ＾ＴＣＧＣＴＧ＾＾ＡＡＡＴＣＧ＾０ＣＴＯＴＴＧＴＴＣＴＣＣＡＲＡＡＧ＾Ｃ＾ＴＧＣＣＧ＾＾ＴＴＴＴＡＴＣＣＣＡＧＯＴＴＣＴＴＧＯＴＯＧＧＣＡＡＡＣＣＣＡＡＡＣＡＡＣＡＡＴＴＣＧＧＣＧＱＣＴＴＧＱＡＡＴ＾ＴＴＡ００ＴＴ０Ｇ＾ＣＧＡＴＴＴＣＴＣ＾ＧＣＡＧＧ＾ＣＴＴ０ＣＧＣＴ０ＧＴＧＡＴＣＡＡＣ０００Ｇ＾ＧＧＴＴ＾＾０Ｇ＾ＣＧＧＴ０Ｇ＾ＴＣＴＡＡ＾ＧＣＴＴＯＣＧＴＴＧＴＴＡＡＴＡＡＡ００＾ＣＧ０Ａ＾ＧＧＣＴＴＣＣＡ＾ＣＴ＾ＴＴＴＴ＾ＴＣＡ＾０ＧＣＴＧＣＡＧＧ＾ＣＯＣＧＧＡＧ＾ＧＧ＾ＴＴＴＣＴＴＴＡ口０ＴＧＧ＾Ｃ０ＡＧＡＧＣＴＡＡＡＴＴＴＡＡＣＣ＾ＧＧＧＴＡＡＣＣＴＣＴＣＡＡＡＣＧＴＣ５１１０２１５３２０ｑ２Ｓ５３０６３５７１０８｝５９５１０５６１６Ｉ２６６３７Ｉ＿７６５８１６８６７９１８９８９０２００７１０７７Ｃ＾ＣＧ０＾ＢＧ０＾ＴＧＧＯＴＧＴ＾＾Ｇ＾ＣＣ＾ＧＴＴＣＴ０Ｃ＾＾＾ＴＣＣＣＴ＾＾ＴＴＴ０＾Ｃ＾ＴＧ＾ＴＧＯ＾ＱＣＴＴＴＣ＾ＣＴ＾ＡＡＡＡｆｌＧ＾ＧＴ＾ＴＣ＾Ｔｅ＾ＣＴＣＣＧＧＧＯＴ＾＾＾ＣＣＣ＾ＧＣ＾０Ｇ＾ＧＯｒＯＣＴＴ＾＾ＴＴ＾Ｇ＾ＣＴＴ＾０Ｃ０＾ＴＴＧＴ００ＡＣ＾＾Ｃ０Ｃ＾ＣＧＧ＾＾＾ＴＴＧＴＧＴ『ＣｒＴＣＣＡＡＯＣＴＴ＾ＣＣＣＴＣＴＴＣ＾０ＣＡＡＧＣＴＴＴＣ＾ＴＣｅＣＣ＾ＡＣ＾ＣＴＣ＾ＴＧＡＧ＾ＣＡＯＧＡＣＡＧＣＣＴ＾ＴＧＴＴＴＡＧＣ０＾Ｔ＾ＡＣ＾ＴＯＴＴＣ０ＡＣＴ＾Ｃ０＾ＴＴ０ＣＧＴ＾＾ＣＴ＾＾ＣＧＣＣＴＴＴＣ吾萋嚣麟搿差毫黑器量慰氍Ａ＾ＣＴＱ０擀搿尝兰吾嚣黼涨擀僦擗ＣＣＴＧＡＴ２４姜威中山大学硕士论文拟南芥Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ基刚与甜菜曲顶病毒（ＢＣＴＶ）作用机制的研究ＳＡＭＤＣ基因（Ａｔ３Ｇ０２４７０）序列（１ｌＯｌｂｐ）：ＴＧＧＣＣＴＴＴＴＧＣＴＣ０ＴＴＴＣＧＧＴＴＣＧ０ＣＧＧＣＴＧＢＧＴＧＣＴＴＴＣＴ＾ＴＧＣＣ＾ＡＣＴＣＴＴＣＣＴ＾ＣＣ＾Ｇ＾ＤＣＴ００ＧＣ＾ＴＣＧＴＣＴＣＴＧＣＧＴＣ＾＾ＣＣＯＴ０ＴＧＧ＾ＴＴＣＴ＾＾ＣＣ＾＾ＴＧＣＧＣＴＧＣ０ＴＣＴＴＴ＾ＴＣＧ＾ＴＣ＾＾ＣＴＣＴＣＴＧ＾ＣＣＣＯＴＯ＾ＴＴＧＣＣ０＾ＴＣＴＣＴＣ＾＾ＣＴＣＴ０ＣＣＣＴＴＣ＾ＣＴＴＴＧＴＣＴＡＣＴ＾ＣＣＴ０ＴＣＴ＾ＴＣＧＣＴ＾ＴＴＧＣＧＴＣ＾ＣＣＣＴＧＴＣＣＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣ＾ＣＴＴＯ＾ＣＴ０Ｔ＾ＣＣ＾＾Ｔ０Ｃ＾ＧＣＴＧＧＴＧＧＣ＾０＾ＣＴＣＣＧ＾＾ＣＧ＾Ｔ０ＴＧＴＣＧＴＣＴＧＡＣ＾０ＣＴＣ０Ｃ＾ＣＡ＾Ｔ＾＾ＧＴＴＴＣＣＴＣＴＧ＾ＧＣＣＣＣＯＯ０ＣＣ＾Ｃ０ＣＣＴＣ＾ＴＴ＾ＴＴＣＣＴＣＣＣＣＣＣＣＴｅＯＯＣＴＣＴＴＴＣＴＴＧＴ＾ＴＧＧＣＣＴＴＣＴＡＧＧＧＣＴ＾ＴＧＣＣｅＴ＾Ｇ＾ＴＧＣ＾ＣＣ＾ＣＴＣＴＴＧＧＧＣＡＴＴＴＧ０ＴＧＴＧ０ＣＴＴ＾ＴＣＴ＾ＴＴＧＣ＾＾ＴＣＣＴＴ＾ＣＴＣＣＧＧＣＴ０＾＾ＣＣＣＴＣＣＧ＾Ｔ０ＴＣＴＣＴＣ００ＴＧＣ０ＴＧ＾０ＴＣＴＯＧ＾０Ｇ＾＾＾＾００ＴＣ＾＾０Ｔ０ＴＴ＾＾ＴＣＧＴ０＾ＧＯＣＴＣ０ＴＧＧＴＤ＾０＾ＣＣ＾ＧＴ＾Ｂ＾ＣＴＡ＾＾＾ＧＣＴＴＧＧＴＣＣ＾ＧＧＣ＾＾ＴＣＴ＾Ｔ０＾ＴＣＴＢ＾ＧＴＣＴＣ＾Ｃ０＾＾＾ＧＴＴＧＡ＾Ｃ＾ＴＣＧＣＣ＾ＣＴ＾ＴＯＣＧＣ＾ＣＣ＾＾ＴＣ０＾ＴＴ０ＣＧ＾Ｇ＾ＴＴ＾＾ＣＴＴＯＧ＾０００Ｔ０Ｔ＾ＣＴＣ＾＾＾＾ＣＣ＾Ｔ＾ＣＣ０Ｃ＾ＴＣＣＴＧＧＣＣＴＡＣ＾ＢＴＣ＾００ＴＴＧ＾ＴＢＣＴ０＾Ｃ０ＣＴＧ＾ＢＣＴＧＣＴＴＧＧ＾Ｇ０ＴＴＣＧＣＣＣＣＣ０ＣＣＴＴ０Ｃ０ＣＴ００＾０ＧＣＴ＾０Ｃ＾ＧＧＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴ＾ＴＯＧＣＣＣ＾０＾ＴＣＣＴＴ０ＴＧＴＧＣＴ＾ＴＣ＾Ｃ＾ＧＣＧＴＴＧＧＡＣＣＧＧ＾＾Ｃ０Ｔ＾ＧＴＴＣＧＧＣＴＧ０Ｔ０ＧＴＣ＾ＣＧＧＣ＾ＧＴＧＧ＾ＧＴＴ＾Ｔ＾＾ＣＴＡＴ＾ＧＧ００ＴＧＴ＾＾ＧＣ＾Ｃ０Ｇ＾ＴＧＴＧＴＴＧ＾ＧＣ＾＾Ｇ＾＾Ｃ０Ｔ＾ＴＴ＾ＧＣ＾ＤＧＴＴ０Ｔ＾ＣＴＴ＾ＧＣ＾＾＾ＴＣ０ＣＣ＾＾ＴＴＴＣＴＧＧ０＾Ｔ０ＴＧＣＣ＾ＱＣＧ＾Ｇ＾ＣＴ＾Ｃ＾＾Ｔ＾＾ＴＴ＾０＾ＯＣＴＧＣ０＾Ｇ０＾ＣＴ＾Ｔ＾ＧＣＧＣ＾ＧＧ＾＾ＧＧ＾Ｃ＾＾ＣＧＣ＾ＧＧ＾＾＾Ｃ＾ＧＯＧ＾Ｔ＾ＣＧ＾Ｃ＾Ｂ口ＧＧ０Ｔ＾Ｂ＾Ｔ＾ＴＴ＾ＣＴ０Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ基因（Ａｔｌ９６０９５０）序列（４４７ｂｐ）．．ｈＴＧＧＣＴＴＣＣＴ０ＣＴＣＣ０ＣＧＣＣＡＴＣＧＴＣ８０Ａ＾ＣＴＴＣＡＴＴＣ＾ＴＣＣＧＴＣＯＴＴＣＣＣＣ＾ＢＣＴＣＣ０＾Ｔ＾ＣＴＣＧＴＴＣＣＣＴＴＣＣ＾ＴＣＡＧＣＣ＾ＡＣＡＣ＾Ｃ＾＾ＴＣＣＴＣＴＣ＾ＣＴＴ＾ＣＡ００ＣＣＣＢＣＴＣＯＴＯＯＴＯＧ＾ＣＧｒ０ＴＣＡＣ＾ＧＣＣＡＴＯＣＴＣＡＣＧＣ＾＾ＢＴ＾ＴＣ＾Ｃ０ＴＴＣＴＣＡＣ＾ＣＣ＾Ｏ＾＾ＯＯＴＧＡＧＣＴ＾Ｇ＾００ＴＴＧＡＧＣ丘ＴＧＴＴ＾ＧＡＣ０『ＯＣＣ＾ＧＣＧＴＣＣＯＴＴＣ＾＾ＣＴＴ０＾ＴＧＣＴＧＣＴＧＡＧＧＡ＾ＧＣＴ０Ｇ＾＾ＴＣＧ＾丁ＴＴＧＣＣＴＴＴＴ＾＾ＣＴＴ０ＣＣＧＴ０ＯＴＴＣＴＴＯＴＴＣＧＡＧＣＴＧｒＧＣＴＧＧＴ“ＡＧＴＴＴ０ＴＣＴＯＴＣＴ０ＴＴＢＣＢＣＢ＾ＣＣ＾Ｇ＾０ＴＴＴＣＣＴＴＧ＾Ｔ０＾Ｔ０＾＾ＣＡＱＴＴＯＴ００ＯＴＴＣＴＯＴＯＣＴ０ＣＴＴＡＣＣＣＴＡＣＣＴＣＴＯ＾ＴＧＴＴＢ＾＾ＣＣＯ＾ＴＴＢＣ＾Ａ＾０＾ＣＣＣＴ＾Ｃ０＾丁Ｔ＾ＯＣ＾Ｔ＾Ｃ＾Ｔ＾ＯＣ＾Ｔ丁＾Ｏ＾Ｃ＾ＴＴ０ＴＴＴＡＡ５Ｏ，２５，，２Ｏ２３＿５３６Ｓ口５７Ｏ８９３＿＿５５８Ｏ，２６３７４７５８Ｂ０７９８９９Ｏａ７Ｏ＿＝００，，５ｌ１０２ｆ５３２０＿２５５３０６３５７４０８４４７ｌ