超微量Na+-K+-ATP酶测定试剂盒，由南京建成生物工程研究所提供 超微量Ca2+-Mg2+-ATP酶测定试剂盒，由南京建成生物工程研究所提供 1.4 实验器械及物品
常规手术器械（大鼠手术板、橡皮筋、棉签、刮毛刀片、剪皮手术剪、中号牙镊、平镊、大鼠腹部特制手术巾、动脉夹、眼科尖头组织镊、眼科手术剪、6/0带针缝合线、眼科持针器、3/0缝线、1ml注射器、5ml注射器、一次性医用帽子、一次性医用口罩、一次性医用手套等）（以上所用手术医疗器械为上海医疗器械厂产品）
NOVEL光学显微镜，型号：XS2-106B（N）。
防脱氨基载玻片，购于天津市灏洋生物制品科技有限责任公司。 莱卡（LEICA）超薄切片机，型号：EMUC6。 日立透射电子显微镜，型号：H7650。 恒温水浴箱，型号：DZW-4型。
精密电子天平，型号：AE16O型电子分析天平。 Heraeus台式高速离心机，型号：PLCO型。 低温离心机，型号：5810R型（德国信肯公司）。
紫外分光光度计，型号：UV755B紫外分光光度计（上海精密科学仪器公司）。 2.实验方法 2.1 动物分组
将64只健康雄性Wistar大鼠，在同样环境下给予基础饲料常规适应性喂养7天后随机分为4组，即正常对照组（未造模干预）、模型对照组、食管康组及西药对照组（奥美拉唑+莫沙必利），每组16只大鼠。对造模组大鼠应用“食管-十二指肠端侧吻合术”进行造模，4天后将造模组成活动物应用数字表法随机分为模型对照组、食管康组、西药对照组（奥美拉唑+莫沙必利）。 2.2 动物模型制备
手术在清洁级动物手术室内进行，实验人员穿消毒隔离服，戴无菌手套。造模组大鼠均于术前24小时禁食不禁水，采用梁新生等[1]改良的“食管-十二指肠端侧吻合术”造模方法，应用10％水合氯醛（0.3ml/100g）腹腔注射，麻醉后将大鼠固定在手术板上，严格按照无菌操作进行模型制作，刀片刮毛备皮、铺单，碘伏消毒后，取上腹部正中剑突下约0.5cm处开腹约2cm进腹，将胃提出，剪断肝胃韧带，显露食管，分离食管下段
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迷走神经及血管，结扎贲门，用动脉夹夹闭食管上段，以防食管回缩，从贲门上0.3cm处切断食管；缝合贲门并荷包包埋入胃中，保留全胃；在十二指肠距幽门1cm处侧壁避开血管纵行切开0.5cm，用无菌纱布将流出十二指肠液吸去，防止流出后感染腹腔；随后将其与食管下段进行端侧吻合（6/0带线缝合针缝合，上海浦东金环医疗用品有限公司），前后左右四壁四针缝合即可，吻合口后壁采用内进内出的内翻缝合法，其余各壁均采用外进外出的外翻缝合法，吻合时黏膜、肌层分别对齐缝合；吻合完毕后，撤去动脉夹用1ml注射器抽吸0.5ml生理盐水，从胃体幽门上0.5cm向十二指肠食管方向插入注射以判断吻合是否缜密，如某壁有漏出，再酌情加针修补；缝合尽量快速，缝合完毕后将胃、食管、十二指肠尽量按原解剖位置回纳，避免粘连，避免损伤肝脏；关腹前腹腔内注入盐酸左氧氟沙星注射液1.5mg/kg（扬子江药业集团有限公司）后分层缝合关腹，消毒皮肤。术后24h禁食不禁水，术后三日内，每天每只大鼠腹腔注入盐酸左氧氟沙星注射液1.5mg/kg，且给予注射用葡萄糖盐水饮用，此后常规喂养。
对模型对照组行假手术。应用10％水合氯醛（0.3ml/100g）腹腔注射，麻醉后将大鼠固定在手术板上，严格按照无菌操作进行模型制作，刀片刮毛备皮、铺单，碘伏消毒后，取上腹部正中剑突下约0.5cm处开腹约2cm进腹，将胃提出，约10min后关腹。术后24h禁食不禁水，术后三日内，每天每只大鼠腹腔注入盐酸左氧氟沙星注射液1.5mg/kg，且给予注射用葡萄糖盐水饮用，此后常规喂养。 2.3 实验步骤 ①正常对照组
16只大鼠于实验开始3天后用生理盐水按照100g体重1ml的比例灌胃，每日2次，与治疗组同日处死。 ②模型对照组
16只大鼠按上述造模方法造模，于造模后3天用生理盐水按照100g体重1ml的比例灌胃，每日2次，与治疗组同日处死。 ③各治疗组
即食管康组、西药对照组2组，每组16只大鼠。于造模术后3天开始，用相应药液按照100g体重1ml的比例灌胃，每日2次，经治7天后，第8天处死各组动物进行指标检测。 ④处死及取材
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以上各组动物处死前，均禁食24小时，不禁水，之后用10%水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔注射麻醉，常规开腹后迅速取出食管组织，将食管纵切两份，一份放入10%福尔马林固定液中送病理科，另一份称重后用生理盐水制备10%食管匀浆，4℃，3500r/min，离心15min，取上清待测。 2.4观察指标及指标检测方法 2.4.1一般状态
包括大鼠饮食、被毛、反流程度、体重、死亡率等，大鼠体重变化采用造模后体重减去造模前体重，取其变化值进行观察。 2.4.2食管黏膜的肉眼表现及病理形态学观察
食管黏膜肉眼表现及病理形态学观察：各组大鼠麻醉后，迅速开腹，取自胃食管交界上0.5cm处向咽喉部截取1.5～2.0cm长食管，用冰生理盐水漂洗食管腔，肉眼，观察大体表现并进行肉眼RE分级后迅速放入10%福尔马林固定液中，防止组织自溶；后送病理科制备食管组织石蜡切片及HE染色，方法如下：
（1）标本常规脱水、石蜡包埋、制备组织切片：80％乙醇溶液30min32次→95％乙醇溶液30min32次→100％乙醇溶液20min→100％乙醇溶液25min→二甲苯透明20min→液体石蜡浸蜡2h→石蜡包埋、组织切片。
（2）切片常规脱蜡入水过程：二甲苯30min→100％乙醇Ⅰ漂洗三次→100％乙醇Ⅱ漂洗3次→95％乙醇Ⅰ漂洗3次→95％乙醇Ⅱ漂洗3次→90％乙醇漂洗3次→80％乙醇漂洗3次→自来水漂洗3次。
（3）染色过程：苏木素染色2min→自来水漂洗1次→1％盐酸酒精（95％乙醇配制）漂洗1次→自来水漂洗3次→1％氨水（75％乙醇配制）漂洗1次→自来水漂洗3次→伊红染色2min→自来水漂洗1次。
（4）常规脱水过程：80％乙醇漂洗1次→90％乙醇漂洗1次→95％乙醇漂洗1次→100％乙醇Ⅰ漂洗3次→100％乙醇Ⅱ漂洗3次→二甲苯浸泡5min（透明）→树胶封片，室温晾干。
通过光镜观察对其进行RE病理分级（注：大体表现及病理分级均采用2010年中华医学会消化内镜分会颁布的《反流性食管炎诊断及治疗指南》见表1、表2）。
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表1 反流性食管炎肉眼表现分级
分级 食管粘膜内镜下表现 积分 0级 正常(可有组织学改变) 0 Ⅰa 点状或条状发红、糜烂< 2 处 1 Ⅰb 点状或条状发红、糜烂≥2 处 1.5 Ⅱ级 有条状发红、糜烂，并有融合， 2
但并非全周性，融合< 75 %
Ⅲ级 病变广泛，发红、糜烂融合呈全 3
周性，融合≥75 %
表2 反流性食管炎病理分级
分 级
病理改变 轻度 中度 重度 鳞状上皮增生 + + + 粘膜固有层乳头延伸 + + + 上皮细胞层内炎细胞浸润 + + + 粘膜糜烂 - + - 溃疡形成 - - + Barrett’s食管改变 - - +/-
注：病理分级积分：正常为0分，轻度为1分，中度为2分，重度为3分
2.4.3食管组织匀浆步骤
动物麻醉后，开腹取食管组织约1.5～2.0cm，以冰生理盐水冲洗漂净，肉眼观察及留取小块组织制作病理切片后，剩余食管组织保存于液氮中，标本收集完成后，在进行组织样本检测前，标本经滤纸拭干，准确称重，以0.9%NaCl溶液（PH7.4）作为匀浆介质，匀浆1min，制备成10％（100mg：1ml）的组织匀浆，4℃离心（3500转/分，10min），取10％匀浆上清液，再用生理盐水10倍稀释成1％，同时用考马斯亮兰法测定组织蛋白，按试剂盒说明进行操作，如果测试结果太高，再将1％的组织匀浆稀释成不同浓度再进行预试后再决定取样浓度。 2.4.4食管组织Na+-K+-ATP酶活性的检测
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2.4.4.1定义：规定每小时每毫克组织蛋白的组织中ATP酶分解ATP产生1μmol无机磷的量为一个ATP酶活力单位。即微摩尔磷/毫克蛋白/小时（μmolPi/mgprot/hour）。 2.4.4.2计算公式：
组织、细胞中ATPase=3标准品浓度（0.02μmol/ml）3637.8÷待测样本蛋白浓度（mgprot/ml）
注：6：定义上为每小时，实际操作为10分钟反应； 7.8：反应体系中7.8倍稀释。 2.4.4.3规范操作步骤： ①酶促反应：
双蒸水（ml） 样本（ml） 试剂十（ml） 试剂一（ml） 试剂二（ml） 试剂三（ml）
对照管 0.16 - - 0.26 0.08 0.08
混匀，37℃准确反应10分钟，
试剂四（ml） 样本（ml）
0.1 0.1
混匀，3500转/分，离心10分钟，取上清定磷
②定磷：（0.02μmol/ml磷标准液及显色剂的配制见说明书：货号：A070-2）
双蒸水（ml） 0.02μmol/ml磷标准液
上清液（ml） 显色剂（ml）
试剂六（ml）
Na+K+-ATPase测定管
0.12 0.1 0.04 0.26 0.08 0.08
0.1 -
空白管 0.3 - - 1.0 混匀，室温
1.0
标准管 - 0.3 - 1.0
对照管 - - 0.3 1.0
Na+K+-ATPase测定管
- - 0.3 1.0
静止2分 钟 1.0
25
1.0 1.0