留出浓缩胶所需空间(梳齿长度加1cm)，用异丙醇覆盖,放置约30min。待聚合后，倒出异丙醇，加入浓缩胶，插梳。待聚合后，放入电泳槽，拔梳，用电泳液轻冲加样孔。
(3)上样：取出40ug蛋白，加入53SDS 上样缓冲液，混匀，100°C煮沸5min，迅速取出放于冰上，离心后加入样孔中。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。
(4)电泳：进行SDS-PAGE电泳(浓缩胶50V,40min;分离胶 lOOV,60min)。 (5)转膜：按分离胶大小剪好PVDF膜（聚偏二氟乙烯膜）,PVDF膜预先用甲醇湿润。小心取下凝胶,去除浓缩胶,保留部分分离胶。按顺序叠放:阴极(黑)-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-阳极(红),加满转膜缓冲液,将转膜槽置于冰盒内。电转到PVDF膜18 (0.4A,45min)。
(6)封闭：用5%脱脂奶粉配制13TBST20℃封闭2h。
(7)—抗反应：取出PVDF膜至于TBST缓冲液中摇摆,10min 33次。UCP2一抗按1:250反应4℃过夜；anti-complexⅠ—抗按1:1000反应4℃过夜，anti-complexⅣ—抗按1:375反应4℃过夜，actin蛋白—抗按1:1500反应4℃过夜。
(8)二抗反应：取出一抗反应结束后的PVDF膜，分别用TBST洗膜10min33次,分别加入二抗。UCP2二抗按 1:1000 反应 2h,37℃；anti-complexⅠ二抗按 1:2000反应2h，37℃；anti-complexⅣ二抗按1:1000反应2h,37℃；β-actin蛋白二抗按1:1500反应2h,37℃。二抗反应结束后,TBST洗膜10min33次。
(9)ECL显影：显影按照ECL说明书A液与B液等比配置,然后将其均勻涂于PVDF膜的正面，放入暗厘，在暗室中显影，定影。
(10)将显影的图片扫描保存为电脑文件,并用Quantity One分析软件将图片上每个特异条带灰度值的数字化(OD u /mm2)，并取目的条带与对应的内参β-actin条带的灰度值比值作为统计数据。 2.5统计学方法
使用SPSS for Windows 13.0统计软件对数据进行统计学分析，实验数据为计量资料者，实验数据以均数±标准差（X?S）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-way
anova）；组与组之间比较采用成组t检验；实验数据为计数资料，采用行3列χ2检验，P<0.05有统计学意义。
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3实验结果
3.1食管组织UCP2活性的检测
表9 UCP2灰度值参数与内参β-actin灰度值参数比值（X
正常组 模型组 食管康组 西药组
UCP2/β-actin 0.035±0.007 0.356±0.026* 0.186±0.012**△ 0.227±0.015**
△
?S）
注：与正常组比较，*P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.05；与西药组比较，P＜0.05；
由表3图3可以发现，模型组大鼠食管组织UCP2活性较正常组明显升高，差异具有显著性意义（P<0.01），食管康组及西药组大鼠食管组织UCP2活性较模型组明显降低，差异具有统计学意义（P<0.05），食管康组与西药组比较，食管康组大鼠食管组织UCP2活性降低更加显著，差异具有统计学意义（P<0.05）。 3.2食管组织呼吸链复合物Ⅰ、Ⅳ活性的检测
表3 complexⅠⅣ灰度值参数与内参β-actin灰度值参数比值（X
正常组 模型组 食管康组 西药组
complexⅠ/β-actin 1.624±0.071 0.354±0.015* 0.733±0.048**▼ 0.681±0.057**
?S）
complexⅣβ-actin 1.982±0.071 0.275±0.015* 0.612±0.027**▼ 0.668±0.083**
注：与正常组比较，*P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.05；与西药组比较，▼P>0.05；
由表3图3可以发现，模型组大鼠食管组织complexⅠ、Ⅳ活性较正常组明显降低，差异具有显著性意义（P<0.01），食管康组及西药组大鼠食管组织complexⅠ、Ⅳ活性较模型组明显升高，差异具有统计学意义（P<0.05），食管康组与西药组比较，大鼠食管组织complexⅠ、Ⅳ活性表达升高不明显，差异无统计学意义（P>0.05）。
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4.小结
实验结果显示，模型组大鼠食管组织UCP2活性较正常组明显升高，差异具有显著性意义，食管康组及西药组大鼠食管组织UCP2活性较模型组明显降低，差异具有统计学意义，食管康组与西药组比较，食管康组大鼠食管组织UCP2活性降低更加显著，差异具有统计学意义。模型组大鼠食管组织complexⅠ、Ⅳ活性较正常组明显降低，差异具有显著性意义，食管康组及西药组大鼠食管组织complexⅠ、Ⅳ活性较模型组明显升高，具有统计学意义，食管康组与西药组比较，大鼠食管组织complexⅠ、Ⅳ活性表达升高不明显，无统计学意义。
第三部分 讨论
1.中医对反流性食管炎的认识
中医学虽无“反流性食管炎”的病名，但依据该病发病时的主症特点，可将其归属于中医“吐酸”、“反胃”、“噎膈”、“梅核气”、“呕吐”、“嘈杂”、“胃痞”及“胸痹”等范畴。[2]《黄帝内经》对吐酸就有记载，但多见于胃痛呕吐等疾病中，吐酸是指胃中酸水上泛,不咽下而吐出的病证。最早出现于《素问2至真要大论》[5]:“诸呕吐酸,暴注下迫,皆属于热。”在古籍中,“吐酸”常与“吞酸”并见,二者都属于反酸的范畴。《金匮要略》中对亦有对吞酸的描述，多见于其它脾胃病证中，未单独作为主症描述，秦景明在《症因脉治》[6]中将“吐酸”分为外感吐酸水和内伤吐酸水两种病症。《杂病广要》[7]中将“吐酸”称 之为“噫醋”。在《诸病源候论2噫醋候》:“噫醋者，由上焦有停痰，脾胃有宿冷，故不能消谷，谷不消则胀满而气逆，所以好噫而吞酸，气息醋臭。”详细而准确地描述了本病的症状表现及发病机理。
本病多因情志内伤、饮食失调、劳累过度而发病。若情志不畅, 肝失疏泄, 气机升降失调, 饮食不节, 烟酒过度, 损伤脾胃, 湿热壅结于中焦, 或久病伤脾, 脾气虚弱, 木不疏土, 致使脾胃不和均可导致气瘀互结于食道, 胃之通降受阻, 而见恶心、呕吐、反酸、嗳气、胸骨后痛伴灼热感等症, 甚则食入反出[8]。多数医家也对RE的病因病机进行探讨，李乾构等[9]认为, 该病是以肝气郁结、横逆犯胃、脾胃虚损为本, 胃火浊
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邪上逆为标。段国勋等[10]介绍本病病因一为饮食伤胃, 二为肝气犯胃, 三为脾胃本虚, 病机是胃失和降、浊气上逆和痰气瘀阻胸膈。肖汉玺[11]把忧思恼怒、气郁伤肝、肝木乘土、横逆犯胃、胃失和降、胃气上逆作为其基本病机； 情志不畅、肝气犯胃为其发病关键。叶庆琏等[12]认为, 其病因源于饮食不节, 中焦郁热, 湿浊中阻, 胃失和降; 疾病迁延日久, 脾胃虚弱, 肝气乘伐, 以致脾胃运化升降失司, 气机郁滞, 肝气夹胃浊上逆, 诸证丛生，病机为脾虚肝乘, 中焦气机郁滞, 胃气上逆。
综上所述，食管上及咽喉，下连脘腹，属胃所主。胃为水谷之海，与脾互为表里，二者共司完成受纳运化和输布功能。“脾宜升则健，胃宜降则和”，脾胃的气机升降失常可导致一系列脾胃疾病的发生。脾胃正常生理功能的发挥还与肝的疏泄功能相关，故RE病位主要在食管，与肝脾胃关系密切，基本病机为脾胃虚弱，病机关键为中焦气机升降失常，肝胃不和，胃气上逆。情志不畅、饮食失调、劳累过度或者久病伤脾均可发生。情志不畅，忧郁恼怒，肝失疏泄，横逆犯胃，气机升降失调，清阳之气不能输布，水谷精微无以化纳，浊邪上泛，胃气上逆，胃液随气上逆，发为反酸；或肝郁化火，火灼胃阴，胃失濡养，食管失津，出现烧心之症。总之，本病的主要机理是脾胃虚弱，肝胃不和，胃气上逆，升降失司，从而产生胸骨后或剑突下烧灼感或痛、泛酸、吞咽不畅等症。 2.旋覆代赭汤加减治疗RE的研究现状
旋覆代赭汤出自《伤寒论2辨太阳病脉证并治下》第161条“伤寒发汗，若吐若下，解后心下痞硬，噫气不除者，旋覆代赭汤主之”。原方由旋覆花三两、代赭石一两、半夏半升、生姜五两、人参二两、炙甘草三两、大枣十二枚组成，主治汗、吐、下后表邪已解而脾胃中气受伤，胃气上逆，以致心下痞硬，噫气不除之证。
方中旋覆花味苦而咸，能下气消痰、降逆除噫，代赭石性味苦寒，质重沉降，善镇冲逆。仲景以此二味药命名此方，可见二者在方中的重要作用。代赭石在此方中用量最轻，其意有三：一则其苦寒质重，量大易伐胃而致胃气更虚；二则本证病位在中焦脾胃，代赭石量大则直抵下焦而入肝经，药过病所，难以发挥降胃之功；三则本证心下痞硬而噫气不除，气逆之势已甚，量大重以镇之，恐有压而不服，其气更逆之虑。半夏、生姜配伍，为仲景之常用组合——小半夏汤，二者虽性味辛温，但均俱降逆和胃之功，生姜既能辛散温通化饮，又能和中降逆，半夏既能辛开散结除痞，又能降逆和胃，二者皆同俱升、降之性，可谓升降相因。人参、炙甘草、大枣味甘主补益脾气，三者相合使脾虚得补，脾气健运，从而使脾气得升，脾之清气得升则胃之痰浊得降。诸药相合，标本兼
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顾，升降兼施，共奏“益气健脾，降逆化痰”之功，使脾气升，胃气降，则气逆平，痰浊消。
后世医家对此方的应用发挥甚广，凡辨证属脾胃气虚，气机升降失常所致之病症均可随证加减。此方配伍得当，全方用药升降相伍，恰和脾胃的脏腑生理特点，故此方在脾胃病中应用甚广。现代医家根据“异病同治”理论，应用此方辨证论治反流性食管炎
[13]
、胆汁反流性胃炎、浅表性胃炎、萎缩性胃炎、胰腺炎等病机属于“胃虚气逆，升
降失常”者，均取得显著疗效。临床研究发现，单用旋覆代赭汤治疗反流性食管炎[14]，或配合西药治疗中、重度反流性食管炎 [15] ，均取得显著疗效，与单纯西药组比较，差异有统计学意义，且旋覆代赭汤组在控制RE复发率方面亦显示出明显优势
课题组前期实验研究证实[16-24]，旋覆代赭汤能改善反流性食管炎模型大鼠食管黏膜病理损伤及PH值，降低黏膜组织一氧化氮（NO）浓度，减轻炎症反应，减少食管括约肌松弛，促进血浆胃动素分泌及胃窦黏膜胃泌素基因表达，从而增加食管下段括约肌压力，促进食管正常蠕动，减少病理性蠕动，促进胃排空，减少酸反流，促进RE食管黏膜损伤的修复；同时，能够降低食管黏膜CyclinD1和PCNA的表达，抑制食管黏膜上皮的过度增殖，抑制细胞中环氧合酶-2的表达，增强食管黏膜屏障功能，从而减少炎症因子对食管黏膜的损伤。旋覆代赭汤能够影响反流性食管炎模型大鼠延髓c－fos蛋白含量表达，干预炎症的中枢神经调节机制，影响胆碱能抗炎通路功能，提高其应急能力和活性，干预机体神经—免疫抗炎机制，对RE起到治疗作用。 3. 脾胃虚弱与RE的关系
脾胃虚弱包含了脾气虚、脾阳虚、脾不统血、中气下陷、胃阳虚、胃气虚、胃阴虚及脾胃虚寒等中医证候。其中脾气虚是脾胃虚弱的基本类型，脾气虚证是指脾气不足，失其健运所表现的证候。多因饮食不节，劳累过度，久病耗伤脾气所致。“脾气虚”一词出于《内经》,如《灵枢·天年》篇中有“七十岁，脾气虚，皮肤枯”的论述。其后历代医家对脾气虚证进行深入研究及发挥，指出脾主运化,是气血生化之源，为后天之本。若先天禀赋不足，或素体脾胃虚弱；或后天失于调养，或饮食不节，饥饱失常，或劳倦过度，忧思日久，损伤脾胃；或年老体衰，或大病，久病之后，元气未复，失于调养，均可使脾气亏虚，运化功能失常，导致气血生化乏源，形成脾气虚证。
饮食不节，劳倦过度，忧思日久，禀赋不足，年老体衰，大病初愈，调养失慎都可以导致脾胃虚弱证。《诸病源候论·五脏六腑病诸候·脾病候》：“脾气盛，为形有余，
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