混匀，室温静置5分钟，在636nm处，1cm光径，双蒸水调零，测各管吸光度值。 [注1]：在比色前，将比色皿用自来水冲洗10余次，再用双蒸水冲洗4-5次，以免磷污染。
[注2]：在测试加样前要摇匀后取样。
[注3]：不可用磷酸盐缓冲液或含磷的试剂作为样本匀浆或稀释样本。
[注4]：预试结果将绝对吸光度值（测定管吸光度值-对照管吸光度值）控制在0.2左右为宜。
2.4.4.4测定意义：ATP酶存在于组织细胞及细胞器的膜上，是生物膜上的一种蛋白酶，它在物质运送、能量转换以及信息传递方面具有重要的作用，机体在缺氧及一些疾病状态下，此酶活力发生一系列改变，另外有些遗传疾病也与此酶活力有关。
2.4.4.5测定原理：ATP酶可分解ATP生成ADP及无机磷，测定无机磷的量可判断ATP酶活力的高低。
2.4.5食管组织Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的检测
2.4.5.1定义:规定每小时每毫克组织蛋白的组织中ATP酶分解ATP产生1μmol无机磷的量为一个ATP酶活力单位。即微摩尔磷/毫克蛋白/小时（μmolPi/mgprot/hour）。 2.4.5.2公式：
组织中ATPase活力=3标准品浓度（0.02μmol/ml）3637.8÷待测样本蛋白浓度（mgprot/ml）
注：6：定义上为每小时，实际操作为10分钟反应。 7.8：反应体系中7.8倍稀释。 2.4.5.3规范操作步骤： ①酶促反应:
蒸馏水（ml） 样本（ml） 试剂八（ml） 试剂九（ml） 试剂一（ml）
对照管 0.16 - - - 0.26
26
Ca2+Mg2+-ATPase测定管 - 0.025 0.08 0.08 0.26
试剂二(ml) 试剂三(ml)
0.08 0.08
0.08 0.08
混匀，37℃准确反应10分钟，
试剂四（ml） 样本（ml）
0.1 0.025
0.1 -
混匀，3000-4000转/分离心10分钟，取上清磷
②定磷：（0.02μmol/ml磷标准液及显色剂的配制见说明书）
双蒸水（ml） 0.02μmol/ml磷标准液（ml） 上清液(ml) 试剂五显色剂
- 1.0
- 1.0
0.3 1.0
0.3 1.0
空白管 0.3 -
标准管 - 0.3
对照管 - -
Ca2+Mg2+-ATPase测定管
- -
混匀，室温静止2分钟
试剂六（ml）
1.0
1.0
1.0
1.0
混匀，室温静置5分钟，在636nm处，蒸馏水调零，测各管吸光度值。
注：[1]在比色前，将比色皿用自来水冲洗10余次，再用蒸馏水冲洗4-5次，以免磷污染。 [2]0.1μmol/ml标准磷应用液配制：用时将贮备液100倍稀释，即取0.1ml加蒸馏至10ml。 [3]0.02μmol/ml磷标准液配制：用时将0.1μmol/ml磷标准液用蒸馏水5倍稀释，即取
0.1μmol/ml磷标准液1ml加蒸馏水4ml。
[4]基质液的配制：按试剂一：试剂二：试剂三=260:80:80比例混合，现用现配。 [5]显色剂的配制：用时取一瓶试剂五甲液加入一瓶已预温好试剂五乙液中，充分混匀
提前半小时配制，2-8℃条件下至少可保存5天，多少配多少。 测定意义及原理同Na+-K+-ATPase所述。 2.5统计学方法
使用SPSS for Windows 13.0统计软件对数据进行统计学分析，实验数据为计量资料者，实验数据以均数±标准差（X
?S）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-way
27
anova）；组与组之间比较采用成组t检验；实验数据为计数资料，采用行3列χ2检验，P<0.05有统计学意义。 3.实验结果
3.1食管康颗粒对反流性食管炎模型大鼠一般情况的影响 3.1.1各组大鼠死亡原因分析
正常组大鼠在实验过程中无死亡，造模组大鼠于处死前，48只大鼠共死亡8只，死亡率约为16.67%。其中2只死于弥漫性腹膜炎，2只死于吻合口狭窄，1只死于肠梗阻，3只死于吸入性肺炎。剩余大鼠各组为模型组12只，食管康组15只，西药组13只。各组具体死亡情况（见表3）。
表3造模后7天处死前各组大鼠死亡原因分析
组别n
死亡数（%） 弥漫性
腹膜炎
模型组 食管康组 西药组
16 4（25%） 16 1（6.25%） 16 3（18.7%）
2 0
吻合口 肠梗阻 吸入性肺炎 狭窄 1 1
0 0 1
1 0 2
0 0
统计学结果显示：食管康组、西药组大鼠死亡率较模型组明显降低，差异具有显著性（P<0.05），食管康组与西药组比较，大鼠死亡率降低更明显，差异具有统计学意义（P<0.05）。
3.1.2各组大鼠基本情况变化
正常组大鼠一般状态良好，活动灵敏，被毛光泽，无脱落，双目有神，体重增加。 造模后各组大鼠均有不同程度的活动欠敏捷，动作迟缓，被毛疏松，光泽减弱，甚则晦暗，喜扎堆，厌光。其中模型组大鼠动作迟缓，喜静厌动，被毛枯槁，脱落明显，无光泽，双目无神晦暗，体重呈递减趋势，口周反流物显著增多；西药组口周反流物明显减少，动作欠敏捷，反应较迟钝，被毛欠光泽，但脱落较少，体重经药物干预后减少缓慢，经药物干预后饮水量呈递增趋势。食管康组大鼠大鼠动作灵活，被毛略疏松，有光泽，无脱落，大鼠口周反流物不明显，给药第两周，两组大鼠体重有递增趋势。 3.1.3大鼠体重变化情况
统计学结果显示：实验前各组大鼠体重均在200±20g，无显著性差异；实验后模型组大鼠的体重明显低于实验前，且与实验后正常组大鼠比较，体重降低明显，差异有显
28
著性（P<0.05），说明造模因素使大鼠的体重减轻；实验后食管康组、西药组两个治疗组大鼠的体重虽仍低于实验前体重，但与模型组比较，实验后经治疗各组体重高于模型组大鼠，说明药物治疗对RE大鼠的体重恢复有效；而食管康组大鼠实验后体重恢复较好，高于西药组，说明食管康组中药对大鼠的体重恢复效果较好，差异有统计学意义（P<0.05）见表4。
表4 实验前后大鼠体重变化情况（X实验分组 正常组 模型组 食管康组 西药组
例数（n）
16 12 15 13
?S）
实验前后体重变化（g）
39.6±5.7 －55.9±4.2* －2.1±3.5**△ －29.5±5.3**
与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较**P＜0.05；与西药组比较△P＜0.05； 3.2食管康颗粒对反流性食管炎模型大鼠食管黏膜肉眼表现及病理形态学改变的影响 3.2.1 食管黏膜肉眼表现
正常组大鼠食管黏膜光滑，无增粗、水肿表现，为淡红色，无充血、炎症或粗糙白斑表现；模型组大鼠食管黏膜肉眼积分与正常组结果基本一致；灌胃7天后，模型组可见多数食管下端水肿增粗，中下端黏膜透明层脱落，颜色鲜红，可见点状、条状或片状充血、粗糙、糜烂，部分糜烂融合为溃疡，少数大鼠食管下端黏膜可见“树皮样”增生白斑出现；食管康组大鼠食管下端轻微水肿增粗，多数食管黏膜结构完整光滑，颜色粉红，少数食管黏膜有点状充血发红，未见糜烂，未见溃疡及增生白斑；西药组多数食管较为光滑完整，透明层覆盖完整，颜色淡白，部分食管可见点状或条状充血、粗糙，个别可见片状糜烂，未见溃疡及增生白斑。各组大鼠RE肉眼分级分布及积分情况见表5。
表5各组大鼠食管黏膜肉眼分级及积分（X
?S）
各组肉眼分级分布情况（只） Ⅰa级 1 0 5 1
Ⅰb级 0 3 8 8
29
组别 正常组 模型组 食管组 西药组
例数（n） 0级 16 12 15 13
15 0 0 0
Ⅱ级 0 5 1 2
Ⅲ级 0 4 1 2
积分 0.06±0.27 2.25±0.66* 1.34±0.41**△ 1.73±0.34**
注：与正常组比较，*P＜0.01；与模型组比较，**＜0.05；与西药组比较，△P＜0.05。
图1.各组大鼠食管黏膜肉眼分级及积分
由表3、图1可以发现，与正常组比较，模型组大鼠食管黏膜肉眼积分明显升高，差异有显著性（P<0.01）；食管康组及西药组大鼠食管黏膜肉眼积分较模型组明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）；食管康组与西药组比较，食管黏膜肉眼积分降低更加显著，差异有统计学意义（P<0.05）。 3.2.2 食管黏膜光镜下表现
正常组镜下可见黏膜层表面为非角化复层鳞状上皮，其基底细胞层中有少许黑色素母细胞和内分泌细胞；模型组可见食管黏膜上皮见有广泛急慢性炎细胞浸润，病变有嗜酸性粒细胞，伴有部分黏膜糜烂、脱落，部分食管黏膜有肉芽组织出现；食管康组食管黏膜上皮恢复，炎细胞减少，黏膜见少量炎细胞，基层炎细胞消失，鳞状上皮层次减少；西药组食管黏膜大量炎细胞弥漫、水肿，嗜酸性粒细胞仍存在，基层仍见大量炎细胞浸润，各组大鼠RE光镜下分级分布及积分情况见表6。
表6各组大鼠食管黏膜病理分级及积分（X
?S）
积分
各组病理分级分布情况（只） 正常 15 0 0 0
轻度 1 2 12 9
中度 0 6 2 3
重度 0 4 1 1
组别 正常组 模型组 食管康组 西药组
例数（n）
16 12 15 13
0.06±0.27 2.39±0.67* 1.21±0.61**△ 1.55±0.71**
注：与正常组比较，*P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.05；与西药组比较，△P＜0.05。
图2.各组大鼠食管黏膜病理分级及积分
由表4、图2可以发现，模型组与正常组比较，大鼠食管黏膜病理积分明显升高，差异有显著性（P<0.01）；食管康组及西药组大鼠食管黏膜病理积分较模型组明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）；食管康组与西药组比较，食管黏膜病理积分降低更加显著，差异有统计学意义（P<0.05）。
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