3.3食管康颗粒对反流性食管炎模型大鼠食管黏膜组织Na+-K+-ATP酶的影响
表7食管康颗粒对RE大鼠食管组织Na+-K+-ATP酶活性影响（X组别 正常组 模型组 食管康组 西药组
例数(n) 16 12 15 13
?S）
Na+-K+-ATPase/U／mgprot
0.85±0.12 0.21±0.06* 0.73±0.10**△ 0.56±0.09**
注：与正常组比较，*P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.05；与西药组比较，△P＜0.05。
图3. 食管康对RE大鼠食管组织Na+-K+-ATP酶活性影响
由表5、图3可以发现，模型组与正常组比较，大鼠食管组织Na+-K+-ATP酶活性明显降低，具有显著性差异（P<0.01）；食管康组及西药组大鼠食管组织Na+-K+-ATP酶活性较模型组明显提高，差异有统计学意义（P<0.05）；食管康组与西药组比较，食管组织Na+-K+-ATP酶活性提高更加显著，差异有统计学意义（P<0.05）。
3.4食管康颗粒对反流性食管炎模型大鼠食管黏膜组织Ca2+-Mg2+-ATP酶的影响
表8食管康颗粒对RE大鼠食管组织Ca2+-Mg2+-ATP酶活性影响（X31
?S）
组别 正常组 模型组 食管康组 西药组
例数(n) 16 12 15 13
Ca2+Mg2+-ATPase/U／mgprot
0.99±0.14 0.33±0.09* 0.86±0.16**△ 0.58±0.08**
注：与正常组比较，*P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.05；与西药组比较，△P＜0.05。
图4. 食管康对RE大鼠食管组织Ca2+-Mg2+-ATP酶活性影响
由表6、图4可以发现，模型组与正常组比较，大鼠食管组织Ca2+-Mg2+-ATP酶活性显著降低，差异具有显著性（P<0.01）；食管康组及西药组大鼠食管组织Ca2+-Mg2+-ATP酶活性较模型组明显提高，差异有统计学意义（P<0.05）；食管康组与西药组比较，食管组织Ca2+-Mg2+-ATP酶活性提高更加显著，差异有统计学意义（P<0.05）。 4.小结
实验结果显示，造模组48只大鼠在造模术后5天共死亡8只，死亡率约为16.67%。其中2只死于弥漫性腹膜炎，2只死于吻合口狭窄，1只死于肠梗阻，3只死于肺部感染。连续灌胃7天后，模型组死亡4只，食管康组死亡1只，西药组死亡3只。模型组大鼠体重减轻显著，经药物治疗后的食管康组、西药组与模型组比较，在大鼠体重变化上，食管康组、西药组明显改变了模型组大鼠体重减轻的趋势；在大鼠死亡率上，食管康组、西药组均较模型组明显降低；在食管黏膜组织形态学上，模型组大鼠食管黏膜下端显示明显炎症改变，光镜可见黏膜及黏膜下有不同程度的炎细胞浸润，部分黏膜出现溃疡，且有不同程度的糜烂、部分鳞状上皮有不典型增生，食管康组、西药组大鼠食管黏膜肉眼、光镜下表现均改善明显；食管康组、西药组食管组织中Na+-K+-ATP酶及Ca2+Mg2+-ATP酶活力明显高于模型组，且食管康组的Na+-K+-ATP酶及Ca2+Mg2+-ATP酶活性比西药组升高明显。
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第二部分 食管康颗粒对RE模型大鼠食管UCP2及呼吸链复合物
影响的实验研究
1实验材料
1.1 实验动物(同实验一) 1.2 实验药品（同实验一） 1.3 实验试剂配制方法
(1)蛋白裂解液(RIPA)：50mMTris-Hcl (pH7.4), 150mMNaCl l%NP-40,0.1% SDS (2) 30%丙稀酰胺凝胶溶液
(3) 10%过硫酸胺(APS)：O.lg过硫酸胺+lmlddH20 (4℃保存)
(4) 10%十二烷基硫酸钠(SDS): lOgSDS溶于80mlddH20,加热溶解后定容于100ml,室温保存。
(5) 1.5mol/L Tris-Hcl (PH 8.8)：18.165g Tris-base 溶于 90ml ddH2O,用 Hcl调节PH至8.8,定容至100ml。
(6) l.Omol/LTris-Hcl (PH6.8): 12.1gTris-base 溶于 90mlddH2O,用 Hcl 调节PH至6.8,定容至100ml。
(7)上样缓冲液(5x,PH6.8): Tris-base 3.03g/100ml + SDS lOg/lOOml+甘油50ml/100ml+ 溴酚蓝(0.5g/100ml) + Hcl 2ml 室温保存,用时加入 Imol/LDTT(二硫苏糖醇),使之最终浓度为O.lmol/L。
(8)电泳缓冲液(5x Tris-Glycine Buffer): Tris 15.1g + Glycine 94g + SDS 5.0g加入约800mLddH20,揽拌溶解。加ddH2O将溶液定容至1L后,室温保存。 (9)转膜缓冲液(湿转):Tris-base 3.03g/1L+++Glycine 200ml/1L+ 10%SDSIg/IL用时稀释10倍后加入甲醇。 (10) PBS (10XPH7.6): Nad80g/l000ml + Kcl2g/l000ml
(11) TBST (1X ): Nad8.8g+Tris-Hcl[PH8.0]20ml+ 0.05%Tween 20ml,加入800ml ddH2O,搅拌,定容至1L。
(12)Tris-Hcl配置(IL):将 121.1gTris 置于烧杯中,加入 800ml ddH2O。
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14.4g/1L+ 甲醇
(13)3%过氧化氢 (14)DAB显色剂 1.4 实验试剂、器械及物品
UCP2(C-20)一抗购自圣克鲁斯生物技术公司 Anti-ComplexⅠ一抗购自 Invitrogen公司 Anti-ComplexⅣ 一抗购自Invitrogen公司 β-actin 购自杭州华安生物技术有限公司
二抗羊抗鼠和羊抗兔IgG 购自圣克鲁斯生物技术公司 BCA蛋白浓度测定试剂盒 SDS-PAGE蛋白上样缓冲液 全自动组织脱水仪
低温离心机，型号：5810R型（德国信肯公司） 精密可调微量移液器 光学显微镜及纤维照相系统 恒温水浴箱，型号：DZW-4型
Heraeus台式高速离心机，型号：PLCO型 NOVEL光学显微镜，型号：XS2-106B（N） Heraeus台式高速离心机，型号：PLCO型
紫外分光光度计，型号：UV755B紫外分光光度计（上海精密科学仪器公司） 2.实验方法
2.1 动物分组（同实验一） 2.2 动物模型制备（同实验一） 2.3 实验步骤 ①正常对照组
16只大鼠于实验开始3天后用生理盐水按照100g体重1ml的比例灌胃，每日2次，与治疗组同日处死。 ②模型对照组
16只大鼠按上述造模方法造模，于造模后3天用生理盐水按照100g体重1ml的比例灌胃，每日2次，与治疗组同日处死。
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5mg/ml BSA蛋白标准品
③各治疗组
即食管康组、西药对照组2组，每组16只大鼠。于造模术后3天开始，用相应药液按照100g体重1ml的比例灌胃，每日2次，经治7天后，第8天处死各组动物进行指标检测。 ④处死及取材
以上各组动物处死前，均禁食24小时，不禁水，之后用10%水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔注射麻醉，常规开腹后迅速取出食管组织，将食管纵切两份，一份放入10%福尔马林固定液中送病理科，另一份称重后用生理盐水制备10%食管匀浆，4℃，3500r/min，离心15min，取上清待测。 2.4观察指标及指标检测方法 2.4.1 western blot实验步骤
(1)提取蛋白：
取100mg冻存组织在冰上剪成碎片、研磨,用预冷PBS洗3次后,离心弃去PBS。加入50ul预冷RIPA (临用前加入PMSF、抑蛋白酶肽)用4℃玻璃匀浆器匀浆20-40次,直到95%细胞被裂解。移至冰浴中放置裂解30 min后，每隔5min在涡旋混合仪中震荡30s。然后在4℃下12000rpm离心10min，取上清分装于0.5ml离心管中即得到组织蛋白，并置于－20℃保存。
(2)SDS-PAGE凝胶配制
试剂 分离胶10% 浓缩胶5% DDH2O 2.5ml 3.8ml 30?r/bis 2.6ml 0.80ml 1.5mol/L Tris (PH8.8) 2.1ml - 1.5mol/L Tris (PH6.8) - 0.72ml
10%SDS 0.1ml 0.06ml 10%AP 0.1ml 0.06ml TEMED 0.004ml 0.006ml
配置SDS-PAGE凝胶前检查底座胶条应当干净，不能有结晶颗粒。先配置分离胶，后配置浓缩胶。分离胶溶液配置完成后，迅速向两玻璃板的间隙中灌注分离胶，预
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