项目名称： 实体肿瘤的微环境蛋白质组研究 起止年限：依托部门：徐宁志 中国医学科学院肿瘤研究所 2011.1至2015.8 卫生部
首席科学家：
二、预期目标
1．总体目标
本项目研究的总体目标是，系统分析结肠癌的体外和体内模型中肿瘤微环境的分泌蛋白质组，揭示分泌蛋白质对巨噬细胞、成纤维细胞和结肠上皮细胞的基因表达和功能影响，深入探讨肿瘤微环境中分泌蛋白质在肿瘤发生和发展过程的作用机制。本项目将通过多种细胞共培养体系和蛋白质组分析获取结肠癌微环境中四种主要细胞相互作用所产生的分泌蛋白质组；将采用标记或非标记的蛋白质组方法，准确测定不同的细胞类型对于细胞共培养系统的总分泌蛋白质的定量贡献；将运用微环境的分泌蛋白质信息，研究它们在结肠上皮细胞癌变、巨噬细胞和成纤维细胞功能异化过程中的分子作用机制；将有效整合小鼠动物模型与细胞模型的分泌蛋白质组数据，发展检测肿瘤相关的生物标记物的测定方法。通过本项目的执行，我们将全面系统地加深对于实体肿瘤微环境的分泌蛋白质组的了解，革命性地改变传统分泌蛋白质组的研究方法，具体回答肿瘤微环境与肿瘤发生和发展相关的生物学问题。
2．五年目标
1) 针对肿瘤微环境研究，发展一整套多种细胞共培养的分泌蛋白质的定量分析
方法；
2) 同一生物材料的背景下，系统研究肿瘤微环境相关细胞的蛋白质组和生物学
行为；
3) 发现可应用于临床的结肠癌相关蛋白质标志物和药物靶标； 4) 在国际主流杂志发表论文30篇左右，申请发明专利5-10项；
5) 造就一支具有综合素质队伍，培养横跨肿瘤基础医学、细胞生物学和蛋白质
组学领域的多方位科学人才。培养一批博士研究生10-15人，硕士研究生20-25人，博士后研究人员5-10人。
三、研究方案
1. 学术思路
实体肿瘤微环境是一个相当复杂的开放系统，如何合理简化肿瘤微环境的相关因素是这个领域研究工作所必须考虑的关键问题。功能明确和细胞数量较多的肿瘤相关细胞是研究肿瘤微环境较为理想的候选细胞，例如肿瘤相关巨噬细胞、成纤维细胞和上皮细胞等。肿瘤微环境中各种细胞的主要通讯分子之一是存在于细胞间液的分泌蛋白质，它是微环境中各种细胞所分泌蛋白质的综合产物。系统地分析肿瘤组织中的分泌蛋白质组，定量地估算肿瘤相关细胞和肿瘤细胞对总分泌蛋白质组的贡献，是肿瘤微环境研究工作中最为基本的要求。应当选择科学问题明确和前期实验数据翔实的实体肿瘤作为本项目的研究对象，而结肠癌正是这样一个典型实例。就具体研究材料而言，保持体外和体内实验的生物材料一致性将极大地减少非实验性来源的误差。C57小鼠背景的细胞和结肠癌模型是具有可操作性的选择。就蛋白质分析策略而言，整合现代蛋白质分析技术可保证肿瘤微环境分泌蛋白质研究的系统性和严谨性，如亲和层析方法富集低丰度分泌蛋白质、高精度质谱仪提高蛋白质鉴定的准确性和灵敏度、体内或体外标记定量蛋白质组技术分析差异分泌蛋白质、MRM技术测定潜在的蛋白质标志物。
2. 技术途径
为了避免实验的误差和技术路线的偏好，本项目将在各课题组实行较为统一的技术途径，如图1所示：
图1. 技术路线示意图
在这些技术环节中，我们特别强调下列的技术特点：
1) 高精度质谱仪应用于分泌蛋白质组分析：已建立高通量和高精度的质谱分析
平台，拥有Velos Orbitrap和MaXis质谱仪。这些质谱仪在质谱信号的分辨率和MS/MS扫描速度上已达到当前的最高水平，完全满足分泌蛋白质的肽段分析。
2) 单克隆抗体或重组蛋白质在亲和层析中的应用：在分泌蛋白质或蛋白质生物
标志物的研究中，亲和富集技术是至关重要的。本课题相关团队已建立高通量的蛋白质重组表达和单克隆抗体制备系统，可以实现亲和材料的研发和制备。
3) 定量蛋白质分析技术：广泛采用蛋白质组的定量技术，在标记定量法中主要
采用iTRAQ法，而在非标记定量中主要采取MRM法。同时开展蛋白质组定量分析的统计方法和计算机软件的开发。
4) 小鼠细胞系和结肠癌动物模型：采用两种C57小鼠背景的结肠癌模型
—AOM-DSS和APCmin，同时所用的小鼠细胞系同样来自于C57小鼠的遗传背景。
本项目研究已具备了较好的技术平台支撑，承担单位拥有2个国家重点实验室，3个部级重点实验室，项目所需的绝大部分实验仪器和实验手段均已具备，各承担单位间有着长期的良好合作关系和基础。本项目的研究队伍具有丰富的前期工作积累与相关研究成果及多学科背景，已经建立起成熟的研究手段和方法，
有能力完成所计划的研究任务。
3. 创新性和特色
本项目的创新之处集中表现在下面五个方面：1）首次提出了简化肿瘤微环境的实验方案，试图从四种微环境相关的细胞着手，重点考察它们相互作用所产生的分泌蛋白质对肿瘤发生和发展的影响；2）与传统的分泌蛋白质研究所不同的是本项目特别强调多种细胞共培养才是研究肿瘤微环境分泌蛋白质的可行实验方案，二元或三元细胞培养体系及其蛋白质组分析构成了体外细胞实验的主体；3）重视定量蛋白质组分析在二元/三元培养系统中的应用，不仅仅要了解共培养体系的分泌蛋白质谱，还要定量测定不同细胞在总分泌蛋白质谱图中的贡献；4）首次在同一遗传背景的小鼠模型和细胞模型上开展系统的肿瘤微环境研究，其中体外细胞培养探索肿瘤相关分泌蛋白质，而体内动物模型验证和发现肿瘤相关蛋白质；5）参与本课题的团队来自我国肿瘤学界和蛋白质组学界的优秀实验室，在肿瘤微环境、分泌蛋白质、动物模型和蛋白质组研究方面都具备相当的实力。从地域分布而言，参加的研究团队来自于我国的东西南北中，本项目在真正意义上实践了集中全国精英，团结攻关的理想。
4. 取得重大突破的可行性分析
本项目瞄准了当前肿瘤研究的热点和重点，即肿瘤微环境的分子研究。在项目的执行过程中，我们将建立一套完全新型的肿瘤微环境研究系统，试图从同一遗传背景的小鼠模型中找到体外和体内所共享的肿瘤相关分泌蛋白质，籍此开展它们对巨噬细胞和成纤维细胞异变分子机制的探讨，开展它们对上皮细胞癌变的诱导机制研究。我们有信心在肿瘤微环境分泌蛋白质领域开辟一条新的道路，在结肠癌相关的蛋白质生物标记物鉴定和测定，结肠癌发生和发展的分子机制研究等方面取得突破。我们的信心植根于：1) 本项目所提的生物学问题和技术困难在国际间仍然悬而未决，我们和其他的竞争者正处在同一起跑线上；2）参与本项目的各个团队在相关的领域处在先进水平，某些课题已取得了进展；3）参与本项目的实验室已具备开展此项研究的所有的实验条件，特别是已搭建蛋白质组分析平台和已拥有小鼠模型和相关细胞。
同时，项目首席科学家和课题组长在科研项目的组织和协调方面具有丰富的