下，正常成纤维细胞可能向TAF转变。我们将在缺氧或低pH条件下观察正常成纤维细胞的形态和功能变化，并测定处理前后成纤维细胞内蛋白质组的差异变化。结合上述结肠癌细胞的分泌蛋白质或癌细胞与TAF二元共培养的分泌蛋白质对正常成纤维细胞的形态和功能变化。将这两种不同处理方法所造成的成纤维细胞功能和蛋白质丰度改变进行比较，可望在一定程度上阐明应激因素条件下肿瘤细胞对TAF形成的调控机制。
5.3 典型TAF分泌蛋白质对结肠癌细胞生物学行为的影响
为了筛选并验证TAF分泌的细胞因子对肿瘤细胞的影响，我们将首先收集单独培养小鼠TAF和人TAF克隆的条件培养基，用这些培养基培养CT26或Caco-2，并观察刺激前后结肠癌细胞的恶性程度的改变，如侵袭能力、划痕愈合能力、增值速率等。 然后，用结肠癌与TAF二元共培养的条件培养液来刺激CT26或Caco-2的生长。在此基础上，进一步利用生物信息学和已知的TAF分泌蛋白质组，筛选TAF分泌蛋白质中可能诱导癌细胞恶变的关键蛋白质。将候选的关键TAF分泌蛋白质在哺乳细胞中表达并纯化，用这些重组蛋白质刺激结肠癌细胞，从而分析TAF中调控肿瘤细胞生物学行为的分子机制。
课题承担单位：复旦大学
课题参加单位：暨南大学、四川大学 课题负责人：施前
科研骨干：张丽军、晏光荣、夏晴、仝爱平 经费比例：23%
课题3. 肿瘤微环境分泌蛋白质介导的上皮细胞癌变的机制研究 课题背景
在结肠、乳腺、胃和胰腺癌等实体肿瘤中，非肿瘤细胞占有较大比例，而其中正常上皮细胞数量最多。在任何上皮来源实体肿瘤发生的早期，恶性上皮都被大量的正常上皮细胞所包围，恶性上皮细胞需要在与正常上皮持续的信号传递过程中逐步获得竞争优势，进而发展成为实体肿瘤；另外，正常上皮细胞可在恶性微环境的诱导下发生恶性转变，不但丧失对周围恶性上皮细胞的抑制作用，成为
肿瘤相关的上皮细胞TAE，而且参与到肿瘤的发生发展过程中，成为肿瘤组织的重要组成部分。因此，正常上皮细胞对肿瘤微环境及实体肿瘤的发生和发展有相当大的影响，是肿瘤微环境中不可或缺的一环，有重要的研究价值。
在癌症发展早期—原位癌和重度非典型增生阶段，正常上皮细胞对肿瘤的发生发展有明显的抑制作用。它们通过与恶性上皮细胞间的接触，如紧密连接、粘合连接、间隙连接等，以及旁分泌途径抑制恶性上皮的增生、维持组织正常状态。当在癌基因/抑癌基因发生异常或者肿瘤恶性微环境的影响下，如微环境中HGF水平升高，作为紧密连接调节复合物的Par3/Par6/aPKC复合体发生异常，不但破坏了紧密连接的正常形态，而且可以通过GSK3?通路调节细胞凋亡。正常上皮细胞在肿瘤微环境中的生物学性状与功能并不是一成不变的，在恶性微环境的刺激诱导下，它们可以发生恶性转化，丧失其正常的肿瘤抑制功能。现已广泛证明在皮肤癌、肺癌、乳腺癌、口腔上皮癌、食管癌、结肠癌、前列腺癌等恶性肿瘤中，癌旁正常上皮细胞中可以检测到与癌组织恶性上皮相类似的基因突变，如杂合性缺失（LOH）、TP53突变等，这成为多发性肿瘤与肿瘤术后复发潜在原因。然而关于这一现象的解释目前众说纷纭，其中有大量实验证据支持“微环境假说”，即癌上皮细胞可以释放某种信号到组织微环境中，而这种信号可以导致周边正常细胞，包括正常上皮细胞发生癌相关基因突变或者表观遗传学的改变。体外实验表明，将正常上皮细胞与恶性上皮细胞共培养可以导致正常上皮细胞增殖能力与侵袭能力的升高，以及MMP-9分泌增多，从而使恶性上皮细胞自身的侵袭能力增加。但是，究竟是哪一些微环境因子促使了正常上皮细胞的畸变尚无定论。
在正常上皮细胞恶性转化的过程中，相较于恶性癌上皮细胞，基质细胞，尤其是成纤维细胞，发挥更为重要的作用。大量试验表明，将无致瘤性的正常上皮细胞或低度恶性上皮细胞与经放射线照射的恶性基质细胞或癌症相关成纤维细胞共同培养，可以使上皮细胞获得致瘤性。导致这一现象的原因，主要是基质细胞，特别是成纤维细胞，释放一系列的蛋白质信号分子，这些蛋白一部分可以直接激活正常上皮细胞中的癌基因相关信号传导通路，而另一部分则通过降解细胞外基质，产生新的信号肽段或使结合到细胞外基质上生长因子得到释放，从而促进正常上皮细胞恶性转化。
在上皮来源肿瘤发生侵袭转移过程中，肿瘤细胞首先发生EMT，即一个通常通过基底膜面与基底膜相互作用的具有极性的上皮细胞发生一系列的生物化学改变，从而获得间叶细胞表型。EMT的主要特征为细胞间连接解体，细胞分散；细胞骨架重排，形成细胞-基质黏附，细胞运动能力增强。近年的研究发现，EMT在多种上皮细胞来源的恶性肿瘤的发生发展过程中发挥了重要作用。上皮细胞发生EMT后，一方面其与周围正常上皮细胞的细胞间黏附减弱，削弱了正常上皮细胞对恶性上皮细胞的抑制作用；另一方面，发生EMT的肿瘤细胞运动侵袭能力增强，而且分泌与原来不同的细胞因子，形成新的有利于侵袭的细胞外基质，成为肿瘤发生侵袭转移的基础。目前研究发现大多数生长因子，包括成纤维细胞来源的生长因子，如HGF、EGF、FGF等通过与其受体结合，激活受体酪氨酸激酶，诱发EMT。EMT是一个非常复杂、涉及大量因子协同作用的复杂过程，经典的研究方法每次仅能对其中的一种因素进行分析，无法全面的揭示微环境诱导上皮细胞发生EMT的分子机制。组学方法，尤其是蛋白质组学地方法将成为我们了解这一复杂调控过程的工具。
目前人们对于正常上皮细胞在肿瘤中作用的研究还相对贫乏，尤其是其对肿瘤微环境中分泌蛋白组的影响以及肿瘤微环境诱导其恶性转化的机制研究更是报道寥寥。现有的文献中只是针对单一模型中个别蛋白的功能描述，无法从整体水平上阐述实体肿瘤中正常上皮细胞的生物学地位。因此，我们依托定量蛋白质组学平台，从广谱分泌蛋白质的角度研究正常上皮细胞与肿瘤微环境之间的互作，将弥补该研究领域的空白。
课题目标
利用细胞生物学和蛋白质组学方法，研究正常结肠上皮细胞在单独培养以及与结肠癌恶性上皮共培养条件下分泌蛋白谱；研究结肠癌发生发展过程中正常上皮细胞分化恶变成结肠癌相关上皮细胞的关键分泌因子以及在癌发生中的作用机制；探索肿瘤微环境诱导正常结肠上皮细胞发生EMT的机制。
研究内容
1. 结肠上皮细胞分泌蛋白质组分析
1.1 建立小鼠上皮细胞系YAMC的分泌蛋白质组谱 1.1.1 小鼠结肠上皮细胞系YAMC的培养 YAMC细胞在胎牛血清的RPMI1640培养基中培养。为了收集YAMC细胞的分泌蛋白质，当正常培养的YAMC细胞生长至80%汇合度时，再将细胞用无血清的高糖DMEM条件培养液培养。
1.1.2 小鼠结肠上皮细胞系YAMC分泌蛋白的收集
YAMC细胞在DMEM条件培养基中分别培养1-3天，每24小时收集一次含有分泌蛋白的条件培养液，离心后收集上清，选择合适的滤膜或超滤管，收集和浓缩分子量大于3KDa的蛋白质，即为分泌蛋白质。 1.1.3 建立小鼠结肠上皮细胞系YAMC分泌蛋白质组谱
收集的YAMC分泌蛋白质用测序级的胰蛋白酶酶解20小时，肽段混合物通过RP trap柱除盐，用nano-反相μHPLC分离，进入Velos OrbiTrap质谱仪测定肽段，采集MS/MS信号，Mascot数据检索蛋白质。建立分泌蛋白质组后，对其蛋白质功能、定位以及生物学功能等聚类分析。同时，动态观察YAMC在不同时间（24，48，72小时）的分泌蛋白质组，为后续分析鉴定小鼠上皮细胞和结肠癌共培养的分泌蛋白质组变化奠定基础。
1.2 小鼠上皮YAMC细胞和结肠癌CT26细胞共培养的分泌蛋白质组分析 1.2.1 建立YAMC和CT26细胞共同培养系统的蛋白质组谱
取对数生长期生长良好的YAMC，以每孔1.5×105个接种到双层共同培养板的下层；取对数生长期生长良好的CT26结肠癌细胞，以每孔1.5×105个接种到双层共培养板上层，待2种细胞完全贴壁后将上层套皿放入接种有下层细胞的6孔板中，由此建立细胞共培养系统，用高糖DMEM培养液33℃、5%CO2进行培养，此时计为0时刻。对照组则将正常肠上皮细胞1.5×105以对应相同数量接种于上下层。待共培养系统建好后，将DMEM培养基换为无血清DMEM培养基，在培养24，48，72小时后，收取共培养系统上清液。上清液蛋白质组分析如上同。
1.2.2 YAMC和CT26共培养体系与YAMC细胞的差异分泌蛋白组分析
将正常培养的YAMC细胞转入含10%透析血清的DMEM培养基加上Leu-d3标记取代正常Leu (即Leu-d0)，约传代4-6次后，检测Leu-d3是否完全取代蛋白
中的Leu-d0，直到细胞完全标记。然后，分别将1.5×105 个Leu-d3标记的YAMC细胞接种双层共同培养板的上、下层，将DMEM培养基换为无血清DMEM培养基，设臵24，48，72小时3个时间梯度收取培养上清液。
分别取等量的无标记体系和Leu-d0标记体系的分泌蛋白质相混合，进行酶解与LC-MS/MS质谱鉴定。从质谱图上含有Leu的肽段的Leu-d0/Leu-d3的一对“轻-重”同位素峰强度的比值即可确定。
1.2.3 YAMC和CT26共培养与CT26细胞的差异分泌蛋白组分析
将正常培养的CT26细胞转入含10%透析血清的DMEM培养基（含[13C6]-Lys标记取代正常Lys），约传代4-6次后，检测[13C6]-Lys是否完全取代蛋白中的[12C6]-Lys，直到细胞完全标记。
分别取等量的无标记体系和[12C6]-Lys标记体系的分泌蛋白质相混合，进行酶解与LC-MS/MS质谱鉴定。从质谱图上含有Lys的肽段的[12C6]-Lys/ [13C6]-Lys的一对“轻-重”同位素峰强度的比值即可确定。
通过上述分析，可望找出小鼠上皮细胞系YAMC和结肠癌细胞系CT26共培养后的分泌组与单独培养的YAMC细胞或CT26细胞的差异分泌蛋白，明确小鼠结肠癌发生发展过程中正常上皮细胞分化恶变成结肠癌相关上皮细胞的关键分泌因子。
1.3 建立人正常肠上皮细胞系NCM460的分泌蛋白质组谱
采用DMEM条件培养基培养NCM460细胞， 在三个不同的培养时间点上收集条件培养基，并进行蛋白质组分析。实验设计与小鼠细胞同。
1.4 人正常上皮细胞NCM460和人结肠癌Caco-2共培养的差异分泌蛋白质组分析
取对数生长期生长良好的人正常肠上皮细胞NCM460和人结肠癌Caco-2细胞，在不同细胞比率和三个培养时间阶段培养细胞，并采用SILAC方法体内标记合成的蛋白质，进行定量蛋白质组测定，完成三个蛋白质组分析：1）NCM460和Caco-2共培养不的分泌蛋白质组分析， 2）NCM460和Caco-2共培养与NCM460细胞的差异分泌蛋白组分析， 和3）NCM460和Caco-2共培养与Caco-2细胞的差异分泌蛋白组分析。