侵袭性结肠癌组织边缘的基质细胞中，成纤维细胞内针对低氧、低pH、ROS的应激蛋白HIF-α、LDH5、TP表达量都明显上调，并且其增殖异常活化。模拟肿瘤微环境（低氧、低pH）的体外培养体系结果表明，成纤维细胞能够低氧培养条件下增殖，并且其分泌的细胞因子Cathepsin-L、VEGF显著升高，细胞的恶性程度增加。在低pH（如乳酸处理）培养的条件下，正常的成纤维细胞其增殖速度表现出对乳酸剂量依赖性增加。这些特性与TAF的表征非常类似，肿瘤微环境中的应激因子可能参与正常成纤维细胞向TAF的转变，但是这些应激因素如何促进成纤维细胞的转变尚无定论。
TAF能够诱发肿瘤形成，在肿瘤发生的阶段起了重要的作用。正常的成纤维细胞可以抑制肿瘤细胞生长，促进肿瘤细胞分化，使其恶性表型消失，对于维持上皮细胞的稳态有重要作用。相反，TAF诱导和促进上皮细胞发生恶性转变，当TAF与肿瘤细胞共培养时，能明显地刺激肿瘤细胞生长。有证据表明，TAF分泌Stromal-Cell Derived Factor-1（SDF-1）、Vascular Endothelial Growth Factor（VEGF）、Fabroblast growth factor（FGF）等细胞因子，它们作用于肿瘤细胞和内皮细胞表面的受体，促进肿瘤生长及增加血管生成，进而提高肿瘤的恶性程度。TAF分泌的趋化因子还引发巨噬细胞浸润至肿瘤组织。
实体肿瘤细胞及TAF所分泌的细胞因子在TAF的形成、肿瘤发生和生长、血管生成、肿瘤细胞的浸润和转移过程中的作用已逐渐被人们所认识，然而，目前关于肿瘤细胞与TAF之间关系的研究仍存在以下问题：1）目前仍缺乏一个系统的、全面的针对肿瘤细胞及TAF分泌蛋白质谱图的研究；2）肿瘤微环境中的应激因子，如缺氧、酸性等，对TAF及正常成纤维细胞分泌蛋白的差异调控，及由此介导的对肿瘤生长侵袭等重要功能的影响，还是一个相对空白的研究领域；3）由于大部分分泌蛋白质的浓度极低，蛋白质组分析技术在检测灵敏度上显得力不从心；4）尽管肿瘤细胞分泌蛋白质对成纤维细胞的影响已有所研究，TAF分泌蛋白质对肿瘤或肿瘤转移的分子机制研究却鲜见于文献。
研究目标
本课题的研究目标是构建一个肿瘤细胞与TAF相互作用的体外培养模型，利用蛋白质组学的方法鉴定肿瘤细胞及TAF的分泌蛋白质谱，并结合定量蛋白
质组学的手段监测肿瘤细胞及其微环境因子诱导成纤维细胞转化为TAF过程中蛋白质和信号通路的变化，以及TAF（或TAF分泌蛋白）作用下肿瘤细胞的生物学特性与分泌蛋白质变化，最终为揭示TAF与肿瘤细胞之间的相互关系与作用机制提供系统性的解释，为肿瘤治疗提供新思路、开辟新途径。
研究内容
1. TAF细胞的分离、培养、多维细胞共培养和应激因子刺激体系的构建 1.1 小鼠TAF及正常成纤维细胞的分离和培养
我们将从AOM-DSS或APCmin小鼠结肠癌模型的肿瘤组织中分离TAF，从C57正常小鼠的肠粘膜组织中分离正常成纤维细胞。利用差数贴壁法及对胰酶敏感度不一致的特性将上皮细胞与成纤维细胞分离，并结合TAF特征标志物Vimentin、Prolyl 4-hydroxylase及α-SMA来筛选并建立TAF原代细胞系。后续实验的细胞代龄控制在20代以内。 1.2 人正常成纤维细胞系和TAF细胞系
我们将选取正常的人结肠来源的成纤维细胞系CCD-18Co，并用TGF?1刺激诱导其形成肿瘤相关的成纤维细胞。 1.3 结肠癌细胞与TAF的共培养
我们将选取人结肠癌细胞Caco-2与鼠结肠癌细胞系CT26用于以下实验的研究，通过稳定转染并筛选一个带有荧光标签的肿瘤细胞系，便于共培养后细胞的分选及对肿瘤细胞行为变化的实时观察，从而建立一个快速检测体系。正常及肿瘤相关的成纤维细胞系如上所述。采用Transwell系统来进行两种细胞共培养。取对数生长期生长良好的正常成纤维细胞或TAF，接种到双层共同培养板的下层；取对数生长期生长良好的结肠癌细胞，接种到双层共培养板上层，待两种细胞完全贴壁后将上层套皿放入接种有下层细胞的6孔板中，在无血清培养基条件下进行培养。对照组则为同一种细胞以对应相同数量接种于上下层，由此建立细胞共培养系统。除此之外，我们将分析各种细胞在Conditioned medium 培养条件下的生物行为学变化，并利用三元培养体系的方法来模拟微环境中结肠癌与TAF及TAM之间的关系。
1.4 低氧及低pH细胞培养模型的建立
细胞的缺氧处理：将细胞培养在37℃，并臵于可以控制氧气浓度的Hypoxia Chamber中，模拟实体瘤微环境的氧浓度进行培养。
细胞酸性环境处理：在培养基中添加不同浓度的乳酸来模拟肿瘤微环境中的低pH浓度梯度。 2. 分泌蛋白质研究方法 2.1 分泌糖蛋白质的富集
凝集素（lectin） 是一类糖结合蛋白，能通过专一地识别某一特殊结构的单糖或聚糖中特定的糖基序列而与之结合，它们与糖链的结合是非共价且可逆的，糖蛋白或糖肽被凝集素捕获之后，通常用特定的单糖通过竞争结合凝集素将糖蛋白或糖肽洗脱下来。我们拟采用多种凝集素（multilectin affinity）或连续凝集素亲和层析（serial lectin affinity chromatography，SLAC）处理分泌蛋白质。 2.2 TAF分泌蛋白质的富集
根据目前的文献报道，TAF的分泌蛋白质的种类很多，但是浓度极低，在冷三氯醋酸体系中难于获得沉淀。因此，我们考虑采用三种方法富集分泌蛋白质。1）阴离子树脂法：在收集的条件培养液中加入阴离子交换的磁珠颗粒，然后在高盐条件下洗脱结合的蛋白质；2）肝素树脂法：肝素亲和技术已被广泛应用于细胞因子和趋化因子的纯化，我们将利用这个技术试图部分富集分泌蛋白质；3）MMP亲和法：根据TAF可能分泌较多的MMP蛋白质的特点，制备TIMP-1亲和树脂来富集分泌蛋白质中的MMP家族成员。 2.3 多肽的亲和富集
采用Bruker公司的ClinProt磁珠等方法富集TAF分泌的多肽，在质谱鉴定过程中引入De Novo分析提高肽段的鉴定准确率。在确定有意义的肽段之后，再利用MRM技术开展定量检测分析。 2.4 定量分泌蛋白质测定技术
为了分析结肠癌细胞、成纤维细胞系及肿瘤相关成纤维细胞系（TAF）在单独培养条件下分泌蛋白的差异，我们将采用iTRAQ 的策略来分析各种细胞在单独培养条件下分泌蛋白差异表达谱，构建一个差异谱图数据库，为分析共培养后各自表达谱的变化奠定基础。对于某些已经鉴定的差异蛋白质采用多反应监测（MRM）方法进行较大规模的定量分析。
3. 结肠癌和TAF的分泌蛋白质组研究 3.1 建立结肠癌细胞分泌蛋白质谱
分别在含有胎牛血清的培养基中培养CT26或Caco-2，待其生长至80%汇合度时,再转无血清的培养基继续培养，分别在24、48、72小时收集条件培养基，去除完整细胞及细胞碎片，富集分泌蛋白质，然后利用LC-MS/MS鉴定蛋白质，获得小鼠或人结肠癌肿瘤细胞的分泌蛋白质谱。 3.2 正常成纤维细胞和TAF细胞的分泌蛋白质的比较分析
采取相似的细胞处理方法，将小鼠正常结肠或结肠癌组织上分离的成纤维细胞或TAF，正常的人结肠成纤维细胞系CCD-18Co或转化的CCD-18Co分别培养，并测定它们的分泌蛋白质组。同时，采用iTRAQ方法标记各自的分泌蛋白质，然后利用三重四极杆质谱仪分析小鼠或人正常成纤维细胞与其对应的TAF的差异分泌蛋白质。
3.3 缺氧、低PH条件下成纤维细胞分泌蛋白质组比较分析
我们将分别收集低氧、低pH值培养条件下正常成纤维细胞及TAF的分泌蛋白，利用iTRAQ标记技术进行差异蛋白组分析。 4. 结肠癌与TAF共培养体系的蛋白质组分析
在肿瘤微环境中，肿瘤细胞与TAF通过旁分泌相互影响，共同进化。在这个过程中分泌的细胞因子的变化在一定程度上介导它们之间的交流和反馈，检测共培养前后条件培养基中分泌蛋白的变化能间接的反应它们之间的通讯，并在一定程度上模拟其在肿瘤微环境中的相互调节网络。利用Transwell二元共培养体系，采用SILAC方法分别完全标记不同细胞，利用蛋白亲和层析技术从条件培养基中富集分泌蛋白并进行LC-MS/MS质谱鉴定，结合生物信息学分析共培养条件下分泌蛋白谱图与前期单种细胞分泌蛋白谱图的差异，从而得到共培养前后变化的蛋白谱图。
4.1 建立结肠癌与TAF共培养体系的分泌蛋白质组谱
在Transwell 共培养体系中培养CT26和小鼠结肠癌的TAF或Caco-2和转化的CCD-18Co，分别在24、48、72小时收集条件培养基，并按照前述方法鉴定它们的分泌蛋白质，建立二元共培养系统中的分泌蛋白质谱。 4.2 结肠癌与TAF共培养体系的比较分泌蛋白质组
我们将利用SILAC技术分析Transwell 二元共培养体系中单种细胞与共培养后培养基分泌蛋白成分的变化，并比较条件培养基共培养的方法中各实验组前后分泌蛋白组的变化。为了进一步准确地分析差异分泌蛋白的来源，分别将结肠癌细胞臵于TAF分泌的条件培养基进行培养，将TAF臵于结肠癌细胞分泌的条件培养基中进行培养，对照组则为细胞本身的条件培养基进行处理，通过往条件培养基中加入用于SILAC标记的特异氨基酸，培养一段时间后，收集培养基中的分泌蛋白并比较培养前后分泌蛋白组分的变化，整合Transwell 体系的结果，最终分析出共培养条件下各种细胞系分泌蛋白的变化。结合两部分的实验数据，从而进一步分析共培养后不同细胞系分泌蛋白的动态变化。
4.3 缺氧或低pH条件下结肠癌与正常成纤维细胞共培养的比较分泌蛋白质组 采用缺氧或低pH处理方法，用含胎牛血清培养基二元共培养CT26和TAF或Coca-2和转化的CCD-18Co，然后将培养系统转至无血清培养基中继续培养，并在不同时间点上收集条件培养基。采用iTRAQ方法分别标记处理和非处理条件下的分泌蛋白质，定量比较它们之间的差别。
5. 结肠癌细胞或TAF分泌蛋白质对结肠癌细胞或成纤维细胞的功能影响 5.1 筛选诱导正常成纤维细胞向TAF转变的应答分子和功能研究
为了筛选发现正常成纤维细胞向TAF的转化，我们将分别收集单独培养的小鼠CT26或人Caco-2细胞的条件培养基，然后在这些培养基中培养小鼠结肠成纤维细胞或转化的CCD-18Co，检验结肠癌细胞分泌蛋白质对成纤维细胞的细胞行为和功能的影响，如形态、增殖、凋亡等；同理，我们也将收集TAF的条件培养基、结肠癌和TAF共培养的培养基来考察它们对正常成纤维细胞的影响。在此基础上，结合上述的分泌蛋白质谱和差异分泌蛋白质比较，通过生物信息学分析，筛选出可能与成纤维细胞向TAF转化相关的分泌蛋白质，从而寻找肿瘤细胞或肿瘤微环境中潜在参与诱导TAF形成的关键因子。采用分子生物学的方法在哺乳类细胞中克隆表达和纯化相应的重组蛋白质。在正常成纤维细胞培养基中加入特异的重组分泌蛋白质，能够进一步考察成纤维细胞的TAF转化的分子机制。
5.2 比较应激因素和肿瘤分泌蛋白质对成纤维细胞的TAF转化的影响
据报道由于肿瘤微环境的改变，在应激因子，如缺氧、低pH等刺激的条件