1.2.2 TAM的分离和培养
用无菌的PBS洗涤肿瘤组织，肿瘤碎片孵育于含有1mg/ml胶原蛋白酶I的PBS中1小时，将消化过的组织滤过70?m孔径的滤网。将滤液离心得到沉淀，然后将沉淀悬浮于含有25ng/ml M-CSF的MEM/FBS中培养。在培养细胞24小时后应进行CD14免疫组织化学检验。 1.3 结肠癌细胞与TAM的共培养
将小鼠结肠癌细胞CT26或人结肠癌细胞CoCa-2接种在双层共同培养板的下层，转化的Ana-1、28SC或肿瘤组织中分离的TAM接种于共同培养板的上层（TAM:结肠癌细胞=10:1）在RPM1-1640培养液中培养。 2. TAM细胞分泌蛋白质亲和富集技术的建立 2.1 TAM分泌糖蛋白质的亲和富集
经内质网-高尔基体分泌途径的经典分泌蛋白质大多属于糖基化蛋白质，我们将采用Heprin/ConA串联亲和层析的方法富集分泌蛋白质，洗脱的蛋白质臵于SDS-聚丙烯酰胺胶内，经反复脱水和水化后，然后进行完全的胰蛋白酶消化。收集消化产生的肽段，经LC-MS/MS分析鉴定分泌蛋白质。 2.2 MMPs的定量蛋白质组分析
据已有的报道，TAM可释放多种细胞因子和蛋白酶类，其中基质金属蛋白酶（Matrix MetalloProteinases, MMP）是一种主要的蛋白酶。然而，目前各家实验室报道的TAM相关的MMP大相径庭。我们认为，造成这种局面的一个重要原因是缺乏统一的可准确定量的MMP测定方法。在本课题中，我们提出基质金属蛋白酶的组织抑制剂（Tissue Inhibitors of MetalloProteinases, TIMP）亲和层析和高精度质谱仪相结合的策略，试图精确定量MMP蛋白质组。哺乳动物的TIMP均含有大约125氨基酸的N-端和65氨基酸的C-端，其中N-端以1:1的比例与MMPs相结合，而TIMP-1能够广泛地与各种MMPs相结合。基于这种特性，我们将制备重组小鼠和人TIMP-1蛋白质，然后将TIMP-1重组蛋白质结合于Sepharose树脂，制作成为MMP亲和层析柱。分泌蛋白质与MMP亲和树脂相孵育之后，其中的MMPs可望结合于亲和树脂，MMPs以高盐或酸性溶液洗脱，最后，采用质谱仪鉴定所结合的MMP蛋白质，以MRM技术定量测定差异的MMPs。
2.3 TAM分泌多肽的亲和富集
为了检测在细胞培养液中可能存在的多肽或蛋白酶解产物，我们将采用二步磁珠亲和富集技术收集细胞培养液中的多肽。首先，用ConA/WGA磁珠将培养液中含有糖链的多肽富集下来，然后用RP磁珠富集其他的多肽类。洗脱吸附于磁珠上的肽段，运用LC-MS/MS测定和De Novo分析，鉴定肽段的氨基酸序列。 3. 正常巨噬细胞和TAM细胞的分泌蛋白质组分析 3.1 正常小鼠巨噬细胞和TAM分泌蛋白质组比较分析
该实验将分为两个小组，1）小鼠正常巨噬细胞Ana-1和相对应的转化的TAM；2）在小鼠体内分离巨噬细胞和从小鼠结肠癌组织中分离TAM。这些细胞在含有10?S的RPMI-1640培养液后中，收集所有悬浮和贴壁细胞，再用不含血清的RPMI-1640培养72小时，每隔24小时收集一次细胞培养基。冻干法浓缩分泌蛋白质。用SDS-聚丙烯酰胺变性分泌蛋白质，加入胰蛋酶完全消化蛋白质。蛋白质组分析将分为二个方面进行：1）对于小鼠巨噬细胞和TAM各自的分泌蛋白质组，我们将采用两维HPLC的方法分离消化所产生的肽段，即第一维采用反相色谱柱吸附肽段，NH4OH，pH10，的乙腈梯度溶液洗脱肽段，第二维仍采用反相色谱柱吸附肽段吸附肽段，但是用TFA，pH2.5，的乙腈梯度溶液洗脱肽段。肽段送入Velos OrbitTrap质谱仪来鉴定肽段和蛋白质。2）对于小鼠正常巨噬细胞与TAM之间的差异蛋白质组，我们将用iTRAQ试剂分别标记这两种细胞的分泌蛋白质所产生的消化肽段，然后等量混合分别，运用三重四极杆质谱仪定量分析两种肽段混合物的定量差异。
3.2 正常人巨噬细胞系和人TAM的分泌蛋白质比较分析
采用人巨噬细胞28SC与其转化的TAM为分析对象。基本蛋白质组分析策略同上所述。
4. 结肠癌与TAM共培养体系的蛋白质组分析 4.1 构建结肠癌与TAM共培养体系的蛋白质谱
由TAM分泌的蛋白刺激肿瘤细胞后，肿瘤细胞必然做出相应的反应，其分泌的蛋白质也会发生相应的变化，这些变化又会刺激TAM的分泌，如此造成一个恶性的循环。那么TAM与肿瘤细胞相互作用后，分泌蛋白质又会发生怎样的变化呢？我们将采用小鼠结肠癌细胞CT26 和小鼠TAM细胞Ana-1，人结肠癌细胞Caco-2和人TAM细胞28SC，来开展这两种细胞的互作实验。用培养TAM的培养基来培养结肠癌细胞，然后收集肿瘤细胞培养上清，分析肿瘤细胞分泌的
蛋白质；或在Transwell培养小室中培养TAM和肿瘤细胞，让TAM与肿瘤细胞受到共培养分泌产物的影响，分别收集其培养上清，分析TAM和肿瘤细胞分泌的蛋白质。然后将此蛋白质分泌谱与单独培养TAM或肿瘤细胞的培养基中的分泌蛋白进行比较，得到TAM与肿瘤细胞相互作用后特异改变的分泌蛋白质。 4.2 结肠癌与TAM共培养体系的比较蛋白质组分析
将CT26与Ana-1或Caco-2与28SC进行二元培养，在培养的不同时期，或者不同比例的培养系统中，利用免疫磁珠法分离培养系统中的肿瘤细胞和TAM细胞，然后采用SILAC标记技术定量比较各个细胞的分泌蛋白质对总分泌蛋白质的贡献。同时采用磷酸化蛋白质/肽段富集结合蛋白质组学方法分别分析经过共培养后的结肠癌细胞和TAM细胞与它们单独培养后细胞内蛋白质表达水平和磷酸化蛋白质的差异。
4.3 构建三元共培养体系的蛋白质谱
微环境是由除肿瘤细胞外多种细胞组成的，其中包括巨噬细胞和成纤维细胞。这些细胞之间存在怎样的相互作用呢？这些细胞相互作用后对肿瘤细胞的分泌蛋白质又有何影响呢？我们将选用小鼠结肠癌细胞CT26、TAM细胞Ana-1、TAF细胞，或人结肠癌细胞Caco-2、TAM细胞28SC、TAF细胞。对于小鼠细胞，在Transwell培养小室下层培养CT26，在其下层培养TAF，在上下各层中加入等量的Ana-1；对于人细胞，在下层培养Caco-2，上层培养CCD-18Co，在上下各层中加入28SC细胞。整个Transwell培养小室臵于慢速转动系统中，以防止巨噬细胞的积聚。三元系统的分泌蛋白质组测定如图3.1所述。并将三元分泌蛋白质组与单独培养TAM、TAF或肿瘤细胞的培养基中的分泌蛋白进行比较，可望得到TAM、TAF与肿瘤细胞相互作用后特异改变的分泌蛋白质。 4.4 三元共培养体系的比较蛋白质组分析
在三元培养的不同时期，或者不同比例的培养系统中，采用SILAC技术定量测定各种细胞的分泌蛋白质在总分泌蛋白质中的相对丰度。 5. 结肠癌细胞或TAM分泌蛋白质对正常巨噬细胞的功能影响 5.1 鉴定诱导巨噬细胞向TAM转化的新的细胞因子
我们已知在IL-4、IL-8、IL-10、IL-13、TGF-?、类固醇和PGE2的刺激下，巨噬细胞转向TAM。很多报道也是应用这些因子处理巨噬细胞来研究TAM的功能。除了这些常见因子，是否还有其他细胞因子可以起到同样的作用呢？将正常
结肠细胞的培养液和结肠癌细胞的培养液分别培养正常巨噬细胞，根据TAM具有低表达carboxypeptidase M、CD51、TNF-?，而持续性高表达IL-1、IL-6的特性，检测结肠癌细胞的培养液是否可以诱导巨噬细胞向TAM的转化。如上述所建立的分泌蛋白亲和富集方法分别收集正常结肠细胞的培养液和结肠癌细胞的培养液，应用蛋白质组学的方法（iTRAQ、ICAT、SILAC）比较正常细胞和相应的结肠癌细胞培养基中的分泌蛋白，那些在癌症组表达上调的分泌蛋白，很可能就是促进巨噬细胞向TAM转换的新的诱导因子，或者是结肠癌特有的诱导因子。将所得的候选诱导因子加入细胞培养液中培养巨噬细胞，同样的通过检测巨噬细胞的CD51、TNF?、IL-1、IL-6等的表达水平，来验证它们是否具有促进巨噬细胞向TAM转化的功能。
5.2 正常巨噬细胞转化为肿瘤相关巨噬细胞的蛋白质组动态研究
在二元和三元细胞培养系统中，用不同浓度的肿瘤细胞培养上清处理正常巨噬细胞Ana-1，选择不同处理时间点，采用形态学分析、流式细胞术、ELISA等手段动态观察肿瘤细胞分泌蛋白质群对巨噬细胞转化为肿瘤相关巨噬细胞的影响，采用SILAC或iTRAQ定量蛋白质组学方法以及结合磷酸化蛋白质/肽段的富集（包括抗酪氨酸磷酸化抗体的免疫沉淀和TiO2富集磷酸化肽段），动态分析巨噬细胞转化为肿瘤相关巨噬细胞过程中，巨噬细胞内蛋白质分子表达水平和翻译后修饰（如磷酸化）的动态变化，经过STRING和Pathway Studio生物信息学分析，构建可能存在的信号转导通路网络。
5.3 肿瘤分泌功能蛋白质组对正常巨噬细胞转化的调控机制研究
采用分子生物学、细胞生物学、遗传学方法和信号转导通路研究策略，基于RNAi、基因过表达和基因重组蛋白质分子的处理，建立肿瘤细胞分泌的蛋白质分子群与Ana-1细胞内动态变化的蛋白质群之间的联系，构建肿瘤分泌蛋白调控巨噬细胞转化为肿瘤相关巨噬细胞的信号转导通路网络，阐明肿瘤分泌功能蛋白质群对巨噬细胞转化的调控机制。 5.4 通过靶向干预诱导TAMs表型改变
通过激动和拮抗干预测定TAMs可能的靶通路或靶蛋白的响应，探索是否可将TAMs的表型体外转化为相对正常的巨噬细胞表型。主要评价指标包括：组织蛋白酶的分泌、细胞内IL-12和IL-10表达情况、分泌细胞因子的模式（应用Luminex和蛋白印记队列技术）。
课题承担单位：暨南大学
课题参加单位：中国科学院北京基因组研究所、复旦大学 课题负责人：何庆瑜
科研骨干：娄晓敏、王媛、梁春敏、孙益红 经费比例：23% 课题 2. 结肠癌及其相关成纤维细胞的分泌蛋白质组与肿瘤发展的相
关性研究
课题背景 肿瘤相关成纤维细胞TAF是肿瘤微环境中分布较广而且表型改变了的成纤维细胞。与正常成纤维细胞相比，TAF处于活化状态，在形态结构、生长方式、增殖活性、运动能力以及分泌特性等方面均发生了显著变化。
已有的研究表明，TAF作为主要的一类基质细胞，在肿瘤发生发展过程中与肿瘤细胞间发生相互作用、相互影响。在诱导正常成纤维细胞向TAF转化的过程中，细胞因子扮演了一个重要的角色。肿瘤细胞通过分泌一些细胞因子诱导普通成纤维细胞及前体细胞向TAF的转变，并促进TAF的增殖；新形成的TAF所分泌的一些细胞因子在肿瘤的生长、血管生成、浸润和转移等过程中发挥着关键作用。肿瘤细胞对TAF的作用主要通过细胞因子实现，诸如Transforming growth factor (TGF-?)，Platelet-derived growth factor（PDGF），Extracellular matrix metalloproteinase inducer（EMMPRIN）。例如，TGF-??刺激成纤维细胞，上调Smooth muscle actin（αSMA）的表达，促使成纤维细胞转化为TAF；PDGF与成纤维细胞的PDGF受体结合，促进了有丝分裂相关基因和化学趋化因子的表达，造成了成纤维细胞的增生紊乱；而EMMPRIN是肿瘤细胞的表面含量丰富的粘附因子，分泌的EMMPRIN刺激周围成纤维细胞，加大基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs）的分泌，进一步降解ECM中的各种蛋白成分，破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障，从而促进肿瘤的浸润和转移。
实体肿瘤处于一个低氧、低pH、ROS等应激因子的微环境中，这些因子在促进肿瘤的血管生成及转移过程中行使了重大功能，近年来的研究显示这类应激因子可能还改变了除肿瘤细胞之外的基质细胞。结肠癌的免疫组化结果显示，在