1.5 人上皮细胞系和结肠癌细胞系共培养后的差异分泌蛋白质组与小鼠上皮细胞系和小鼠肠癌细胞共培养后的差异分泌蛋白质组的对比分析和验证 通过生物信息学分析和实验验证，可以找出人上皮细胞系NCM460和结肠癌细胞系Caco-2共培养后的分泌蛋白质组与单独培养的NCM460细胞或Caco-2细胞的分泌蛋白质组的差异，同时对比小鼠上皮细胞系YAMC和结肠癌细胞系CT26共培养后的分泌蛋白组与单独培养的YAMC细胞或CT26细胞的差异分泌蛋白，可以找出利用不同种属（小鼠或人）不同模式细胞系研究结肠上皮细胞分化恶变过程中的共同的分泌蛋白，明确结肠癌发生发展过程中正常上皮细胞分化恶变成结肠癌相关上皮细胞的关键分泌因子。 2. 结肠癌细胞分泌蛋白质对上皮细胞功能的影响
2.1小鼠结肠癌细胞系CT26的分泌蛋白质组对小鼠正常肠上皮细胞系YAMC功能的影响
我们将癌细胞系CT26在无血清培养基中培养后，收集培养基，然后用于培养小鼠正常结肠细胞。完成培养实验之后，我们将系统检测正常小鼠结肠细胞系的功能改变，主要包括：a）蛋白质组的变化，b）细胞的生长特征，如生长曲线、凋亡或老化活性等，和c）细胞形态。
2.2 典型的结肠癌细胞分泌蛋白质对小鼠正常上皮细胞YAMC功能的影响
我们将选择若干典型的结肠癌细胞分泌蛋白质，采用分子生物法制备重组这些分泌蛋白质，然后将这些蛋白质按不同的浓度与小鼠正常结肠细胞孵育。完成培养实验之后，我们将系统检测正常小鼠结肠细胞系的功能改变，主要包括：a）蛋白质组的变化，b）细胞的生长特征，如生长曲线、凋亡或老化活性等，和c）细胞形态。
2.3 二元/三元共培养体系的培养液对小鼠上皮细胞YAMC功能的影响
采用课题一和课题二中产生的二元/三元培养液处理上皮细胞，在不同的细胞培养时间点上观察和分析上皮细胞的功能改变。 3. TAF分泌蛋白质对小鼠结肠上皮细胞功能的影响
3.1 小鼠TAF的分泌蛋白组对小鼠正常肠上皮细胞系YAMC功能的影响
我们将收集培养小鼠TAF的无血清培养基，然后以此培养YAMC，并观察这些细胞的性状变化，例如蛋白质表达状态、细胞生长特征以及细胞生长周期变化等。
3.2 典型的TAF分泌蛋白质对YAMC功能的影响
我们将选择若干典型的TAF分泌蛋白质，采用分子生物法制备重组这些分泌蛋白质，然后将这些蛋白质按不同的浓度与小鼠正常结肠细胞孵育。完成培养实验之后，我们将系统检测YAMC的功能改变。
3.3 不同状态成纤维细胞分泌蛋白组对结肠正常上皮细胞影响的研究
选取正常成纤维细胞系，用TGF-β诱导其转化成为TAF，或用H2O2将其诱导成为老化样成纤维细胞（SLF）。将培养三种不同状态成纤维细胞的培养基处理结肠正常上皮细胞系，并在不同的时间点上收集上皮细胞，然后进行上皮细胞的蛋白质组分析。由于细胞内信号传导很大程度依赖磷酸化通路，因此我们在研究正常上皮细胞系在三种不同分泌蛋白质混合物中的差异蛋白质组的同时，利用IMAC/TiO2亲和树脂纯化磷酸化蛋白质和P-Tyr-100树脂富集酪氨酸磷酸化蛋白质，运用高精度质谱技术（Velos OrbitTrap MS/MS）鉴定磷酸化蛋白质的定量变化，一方面测定磷酸化蛋白质的动态该变；另一方面检测肿瘤细胞与免疫细胞互作过程中蛋白质磷酸化位点的变化。结合三种状态下成纤维细胞的差异分泌蛋白谱，利用生物信息学方法绘制CAF与SLF诱导上皮细胞恶性转化过程中活化及失活的细胞信号转导网络。
4．TAM分泌蛋白质对正常小鼠上皮细胞功能的影响
4.1 小鼠TAF的分泌蛋白组对小鼠正常肠上皮细胞系YAMC功能的影响
收集培养小鼠TAM的无血清培养基，然后以此培养YAMC，并观察这些细胞的性状变化，例如蛋白质表达状态、细胞生长特征以及细胞生长周期变化等。 4.2 典型的TAM分泌蛋白质对YAMC功能的影响
选择若干典型的TAM分泌蛋白质，采用分子生物法制备重组这些分泌蛋白质，然后将这些蛋白质按不同的浓度与小鼠正常结肠细胞孵育。完成培养实验之后，我们将系统检测YAMC的功能改变。
4.3 MMPs家族蛋白质在肿瘤微环境中变化规律及其对小鼠正常上皮细胞的影响
MMPs是肿瘤微环境中功能蛋白质家族的代表，据报道，它也是TAM分泌的主要蛋白质。运用基于MRM的绝对定量和差异蛋白质验证方法，在课题一和课题二所述的二元/三元细胞模型中检测MMPs的动态变化，并应用TIMP亲和技术富集无血清培养基中的MMP蛋白质，将其处理YAMC，观察细胞性状的改变，动态地定量地分析MMPs导致的胞外蛋白质降解谱，寻找它们的主要降解底物。与此同时，也可在培养基中加入较高浓度的某一二种TAM相关的MMP来重复同类实验。利用生物信息学的方法，描绘YAMC被肿瘤微环境诱导恶性转化过程中MMPs家族分泌谱与功能变化规律。 5．结肠癌细胞EMT研究
5.1 结肠癌细胞EMT相关分泌组和脂筏蛋白的蛋白质组研究
构建FOXC2表达质粒，转染CACO-2细胞，观察转染前后的细胞表型变化，并结合Western blot和免疫荧光判断是否细胞是否发生了EMT，筛选稳定表达株。分别用含12C-L-Arg, -Lys和 13C-L-Arg, -Lys的培养基培养亲本和稳定表达FOXC-2的CACO-2细胞，5个细胞世代以后收集细胞，质谱检测细胞蛋白的标记效率。在标记效率接近100%以后，分别大量扩增细胞，待细胞长到70%的融合率时，收集条件培养基，超滤浓缩。同时，用胰酶消化收集细胞，提取细胞脂筏。采用SDS-PAGE分离等量混合的发生EMT前后的细胞分泌蛋白和脂筏蛋白，切取条带，胰酶酶解后，质谱鉴定蛋白质。开展差异表达蛋白谱的生物信息学分析，并构建蛋白质相互作用网络。
5.2 利用蛋白质组技术分析TAF对于结肠癌细胞EMT的影响
按照第一部分的方法诱导结肠癌细胞CACO-2发生EMT，并将亲本细胞和发生EMT的细胞分别进行SILAC标记。待结肠癌细胞标记完全后，PBS洗涤细胞，加入2/3体积的无血清培养基和1/3体积的成纤维细胞分泌上清，继续培养24h，收集条件培养基，超滤浓缩。同时，收获细胞，提取细胞总蛋白/亚细胞组分蛋白或脂筏蛋白；等量混合发生EMT前后的相应蛋白质，用SDS-PAGE分离蛋白质，切取染色条带，胰酶酶解后，经质谱鉴定蛋白质并定量计算差异蛋白质。
课题承担单位：四川大学
课题参加单位：中国医学科学院肿瘤研究所、暨南大学 课题负责人：赵霞
科研骨干：梁淑芳、赵晓航、刘朗夏、朱红霞 经费比例：24% 课题4. 肿瘤微环境分泌蛋白质与动物模型和临床样本的关联分析
课题背景
动物模型在生物学研究的重要性是不言而喻的。对于肿瘤微环境的研究，它的作用更是如此。尽管我们试图简化肿瘤微环境的各个相关环节，建立较为合理的二元或三元共培养体系，综合分析这个体系中的分泌蛋白质组以及对于各种细胞的作用，然而，这些努力最后还必须在动物模型或者人体的样本中被肯定，才真正具备生物医学价值。因此，在本项目中我们特别提出，应当基于小鼠细胞来开展实体肿瘤微环境研究，以充分保证体外细胞培养和体内动物模型在生物材料上的一致性。世界范围内，小鼠的肿瘤造模相当普遍，实体肿瘤的模型也不在少数，不过，这些模型中成功证明了微环境与肿瘤发生和发展的文献还不多见。结肠癌的小鼠模型为这个领域提供了一个范例。
2003年，Mori等在Cancer Science上发表的一篇论文，创造了由结肠炎诱导结肠癌的AOM-DSS小鼠模型。而Karin等人巧妙地利用该模型第一次证明了在动物体内微环境促进肿瘤的发生和发展。在这篇具有里程碑意义的论文中，研究者发现转录因子NF-?B通路的失活扮演了关键角色，能够显著地抑制结肠炎诱导的结肠癌的发生和发展。更为重要的是，选择性地在免疫细胞而不是上皮细胞中灭活NF-?B信号，这样对肿瘤发生的影响不甚明显，却很大程度上减慢了肿瘤的生长速度。此外，特异性地在上皮细胞中灭活NF-?B信号，则明显地减少了肿瘤发生的数目。这些数据清楚地证明，NF-?B介导的炎症反应在肿瘤的发生发展中起着至关重要的作用，同时上皮细胞和免疫细胞在此过程中发挥着不同的作用。这些数据也显示，动物模型对于揭示体内肿瘤微环境的细胞间相互作用的分子机制是何等的重要。
人们利用动物模型模拟研究结肠癌的发生发展由来已久。1990年，Moser等人发现，C57雄性小鼠经过突变剂ethylnitrosourea处理后，其后代里出现了多发肠道息肉/腺瘤的世系。后来研究者证明，该世系小鼠APC单等位基因的第850位氨基酸发生无意义突变。这种化学试剂诱导产生的结肠癌小鼠被命名为APCmin
小鼠。APCmin小鼠真实地模拟了家族性息肉病（FAP）的病程进展，向人们展示了正常粘膜上皮自发肠道息肉、由息肉转变成为腺瘤并最终形成腺癌的病理过程。在这个过程中，错配修复基因（MMR）和APC野生等位基因依次发生了突变。近年来，人们分别构建了在APCmin小鼠模型中的MMR成员（MSH2、MSH6、MLH1）的基因敲除小鼠模型，成功模拟了遗传性非息肉结肠癌（HNPCC）。目前已有一些工作提示在这些结肠癌模型中的肿瘤微环境会发生改变，例如在APCmin小鼠中分泌蛋白S100A8表达量明显升高，但尚没有人对肿瘤微环境的变化及作用进行系统性研究。
APCmin小鼠与AOM-DSS模型从不同角度模拟结肠癌的发生发展过程：前者成功模拟了FAP，凸现了基因突变在结肠癌发生发展中的地位；而后者则强调了外界刺激对结肠癌的诱发作用，为结肠炎/炎症性肠疾病与结肠癌的关系提供了重要依据。然而，这两种模型都无法单独模拟占人类结肠癌85%的原发性结肠癌，而基因突变或炎症也均不可能成为原发性结肠癌的唯一病因。因此，为了更好地还原结肠癌的原貌，更好地与细胞系研究结果和临床组织样本研究结果进行对比，我们将对APCmin小鼠和AOM-DSS模型展开同步研究。
成功的结肠癌小鼠模型固然为肿瘤微环境研究奠定基础，我们也意识到，涉及到微环境的许多分子事件的探索还仅仅是开始。根据目前所报道的实验证据，我们还没有一个清晰的轮廓，哪些分泌蛋白质在结肠癌肿瘤微环境中真正发生了改变？哪些分泌蛋白质在血液循环过程中具备可检测性？究其原因，我们以为有三：首先，在过去的研究报道中体外细胞和体内动物模型的分泌蛋白质分析往往是分离的，测定的方法和数据的判断都有很大的差别，因此很难获得互相印证的结果。其二，没有充分意识到动物模型差异对肿瘤微环境的影响，而事实上利用化学物质造模和基因改造造模所产生的结肠癌可能有一定的性状差别，当然会导致分泌蛋白质的差别。所以，依靠单一动物模型所获取的数据，往往不具广泛的应用价值。其三，蛋白质组分析手段是重要的技术障碍。蛋白质组学是一门相当年轻的学科，技术发展速度极快。在过去一段时间内，蛋白质组技术在蛋白质有效富集和定量测定上尚有不足，不能提供高重现性和准确定量的数据。正是基于这些考虑，我们在本项目上设计了具有针对性的实验方案，力图在这些关键问题上实现革命性的突破。