经验，均承担并完成多项国内或国外的重要科研项目。本项目计划是基于研究团队的研究基础和前期工作而提出的，在本项目的申报过程中，项目专家组及研究骨干多次研讨，围绕本研究计划拟解决的重大科技问题，制定了合理可行的研究方案和技术路线。相信通过学科交叉、集成多种研究方法，我们研究团队完全有可能在本领域取得突破性进展。
5. 课题设臵 课题设臵思路
本项目首次提出体外的实体肿瘤微环境研究，采用简化细胞组分的策略，选择实体肿瘤中几种生物学行为较为清晰而且相对细胞数量较大的细胞为研究对象，系统考察这些细胞相互作用所产生的分泌蛋白质变化以及它们对于实体肿瘤发生和发展的作用。在这一基础上开展小鼠肿瘤模型的体内研究，检验体外实验结果与体内实际发生事件的关联性。根据这样的思路，我们将实体肿瘤的研究对象定位在结肠癌；选择三种微环境相关的细胞来考察肿瘤与其它细胞相互作用所产生的分泌蛋白质；采用两种C57小鼠的结肠癌模型来检验可能的肿瘤蛋白质标志物。
本项目将设臵四个课题，分别为，1）结肠癌及其相关巨噬细胞的分泌蛋白质组与肿瘤发展的相关性研究；2）结肠癌及其相关成纤维细胞的分泌蛋白质组与肿瘤发展的相关性研究；3）肿瘤微环境分泌蛋白质介导的上皮细胞癌变的机制研究；4）肿瘤微环境分泌蛋白质与动物模型和临床样本的关联分析。我们关于课题的设臵是从三个层次上给以考虑的：首先，从简化肿瘤微环境细胞组分着手，我们选择了三个肿瘤相关的微环境细胞，即巨噬细胞、成纤维细胞和上皮细胞。因为我们的基本假设是肿瘤相关分泌蛋白质的研究需要建立在细胞之间的相互作用基础上，这样在简化的微环境体系中就形成了结肠癌细胞与这三种环境细胞的配对，构成了三个二元培养体系和一个三元培养体系（结肠癌细胞/TAM/TAF）。其次，从体外和体内实验着手，虽然我们在本项目中特别强调细胞系的选择必须考虑到来源的遗传统一性，以减少非实验因素的干扰，但是体外的细胞实验结果最终还需在体内模型得以证实。因此，我们设定三个课题开展细胞的实验，从二元或三元系统中分析肿瘤相关分泌蛋白质，而设定一个课题从事于小鼠结肠癌模型的分泌蛋白质分析，试图做到体外和体内的实验数据互相呼应。
再次，从生物学问题着手，一般认为上皮细胞受肿瘤微环境影响可能表现于正常上皮细胞的癌变，而巨噬细胞和成纤维细胞则在微环境作用下可能异化变成TAM和TAF，TAM和TAF可显著地促进肿瘤组织的侵润和转移。因此，在设定课题的生物学问题时，我们有关肿瘤微环境对上皮细胞影响的研究更多地投射在肿瘤的发生机制上；有关肿瘤微环境对巨噬细胞和成纤维细胞影响的研究更多关注于肿瘤的发展机制。在第四课题中，我们则从动物模型中动态地观察微环境对于肿瘤发生和发展的影响。
课题的关联
本项目的四个课题中，三个课题注重在细胞水平上的分泌蛋白质研究，一个课题聚焦于动物体内肿瘤组织的分泌蛋白质和血液中肿瘤相关蛋白质。各个课题之间既存在学术逻辑上的必然联系，又有研究内容上的互为补充。在结肠癌与TAM和/或TAF的分泌蛋白质分析中所得到的结果将应用于上皮细胞癌变的研究中。同样，正常上皮细胞与结肠癌细胞的差异分泌蛋白质又有助于TAM和TAF的功能分析。在细胞水平上的分析结果将体现在第四课题上的结肠癌模型中，而动物模型课题组产生的肿瘤组织又服务于细胞课题组的TAM和TAF的制备。如图2所示，四个课题之间形成了较为完整的研究关联网络，在不同的层次和角度上共同研究结肠癌微环境分泌蛋白质在肿瘤发生和发展过程中的分子机制。
图2. 各课题关联示意图
红色代表课题1，绿色代表课题2，黄色代表课题3，蓝色代表课题4。
课题1. 结肠癌及其相关巨噬细胞的分泌蛋白质组与肿瘤发展的相关
性研究 课题背景
巨噬细胞是肿瘤微环境的一个主要的组成部分。Alberto Mantovani在1978年首次在实体瘤中观察到先天性免疫细胞聚集的现象。近年来研究表明，各种免疫细胞向肿瘤（如乳腺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、淋巴癌、黑色素瘤）的迁移聚集，其数量和细胞种类与癌症病人的预后和生存率呈现非常密切的联系。其中，肿瘤相关巨噬细胞TAMs作为肿瘤中重要的免疫细胞组分被广泛研究。巨噬细胞来源于血液单核细胞，血液单核细胞受肿瘤细胞分泌的如M-CSF，CCL家族蛋白，CXCL家族蛋白等细胞因子或者趋化因子的吸引，被募集至肿瘤病灶，渗入肿瘤内部并进一步转化为TAMs。正常的巨噬细胞具有吞噬肿瘤细胞，向T细胞呈递抗原，表达细胞因子以活化T细胞及NK细胞的能力。与此相反，在肿瘤微环境的若干刺激因子的作用下，巨噬细胞转向TAMs，使其失去了正常功能，反而成为肿瘤病人预后差的标志。大量研究已经表明，TAMs的广泛浸润与乳腺癌、结肠癌、宫颈癌、膀胱癌等肿瘤的不良预后相关。
肿瘤细胞分泌的蛋白质，例如CSF-1、CCL2, 3, 4, 5,6、MCP1, 2, 3, 4, 5、MIP、MIF和VEGF等，可以促进TAMs的聚集，因此，在肿瘤细胞或组织中，这些蛋白质的表达水平与TAMs的数量正相关。TAM所分泌的蛋白质与肿瘤的发生发展有很大的关系。首先，TAM可表达多种刺激肿瘤细胞增殖和存活的细胞因子：EGF、PDGF、TGF-?1、HGF、bFGF、IL-6、IL-1和TNF?等。TAM是EGF刺激肿瘤增殖的重要细胞来源。其次，TAM可存在于基底膜部分，且伴有局部CathB和MMP的蛋白水解酶活性增强，促进了肿瘤细胞向周围正常组织的侵袭。再次，肿瘤生长需要新生血管的形成，这个过程涉及广泛的细胞因子的协同调控，包括bFGF、VEGF、IL-1、IL-8、TNF?、MMP9、MMP2及NO等。这些分子的协调作用促进内皮细胞的增殖、基质重构及血管形成。TAM可释放上述促血管生成的分子，同时表达了一系列参与调节血管发生的酶类，包括MMP2、MMP7、MMP9、MMP12和环氧化酶2，在促进肿瘤组织血管生成过程中发挥重要的作用。最后，TAM还能释放免疫刺激因子从而使肿瘤细胞逃避免疫系统。例如，正常的巨噬细胞表达IL-12，它的功能是促进T细胞核NK细胞的增殖，但是在肿瘤细胞分泌IL-10、TGF?和PGE2的刺激下，TAM失去了表达该因子的能力；相反，将肿瘤细胞和过表达IL-12的TAM共同种植于小鼠时，TAM向T细胞呈递抗原的能力增加，且机体抗肿瘤的能力加强。
在多数肿瘤组织中，肿瘤细胞和巨噬细胞存在一种共生的关系：巨噬细胞在肿瘤细胞及其释放的可溶性分子的趋化下，迁移至肿瘤局部；TAM产生大量的细胞因子则促进肿瘤的生长、增殖、转移及血管形成并抑制免疫细胞的活性。因此，深入探讨在肿瘤微环境中肿瘤细胞与巨噬细胞的相互作用，阐明TAM在微环境中功能变化的分子机制，以发挥巨噬细胞的积极作用，激活其抗肿瘤活性，将可能为未来肿瘤生物治疗提供新的线索。
尽管肿瘤与巨噬细胞的研究已经有了很大的进展，有关这些细胞的分泌蛋白质的报道也频见于文献，人们在这个领域的认知仍然差强人意。我们以为，大致有三个方面亟待加大研究的深度和力度。第一，目前有关肿瘤分泌蛋白质的研究大都关注于单种细胞或癌组织的分泌分子，忽略了癌细胞和其相关细胞实际上生活在一个具体的微环境中，这些细胞的基因表达和分泌状态与肿瘤微环境是密不可分的。第二，现有的文献大都关注于肿瘤细胞或TAM所分泌的某个或某类蛋白，而实际上，在肿瘤微环境中的各种相关细胞所分泌的蛋白是作为一个整体，
相互促进表达，分泌及功能的实施，是一个协同的作用，至今却没有任何一个分泌蛋白质的集合的报道。第三，TAM可分泌大量的基底蛋白质水解酶类或促血管生成的酶类，这些酶类大多属于同一蛋白质家族，但是迄今尚无较为有效的分离和鉴定手段较全面地了解它们的分泌和功能状态，也就无法从这些关键分子出发更为深刻地了解肿瘤细胞和TAM之间的相互作用是如何促进肿瘤的发生发展的。
研究目标
为了全面了解实体肿瘤的癌细胞与TAM之间的相互作用，主要是它们的分泌蛋白质组的构成以及这些蛋白质对癌细胞和巨噬细胞的作用，我们将以结肠癌细胞及其TAM为研究对象，开展如下三个方面的研究：1）定性及定量研究TAM的肿瘤分泌蛋白质组，2）结肠癌细胞分泌蛋白质对巨噬细胞蛋白质组和功能的影响，和3）TAM分泌蛋白质对结肠上皮细胞和结肠癌细胞的蛋白质组和功能的影响。
研究内容
1. TAM细胞的分离、培养和多维细胞共培养体系的构建 1.1正常巨噬细胞和TAM细胞系培养
我们将选用半悬浮Ana-1细胞为C57小鼠巨噬细胞系，28SC细胞为人巨噬细胞系。两个细胞系均用RPMI 1640+10?S培养。在TGF-?1的刺激下，巨噬细胞可转化为TAM。
1.2 体内正常巨噬细胞和TAM细胞的分离和培养 1.2.1 体内正常小鼠巨噬细胞分离和培养
取6周左右的C57小鼠，腹腔注射1毫升无菌的巯基乙酸肉汤，3-4天后处死动物，用外科方法无菌摘取小鼠脾脏和胸腺，臵于盛有预冷RPMI-1640，1%小牛血清培养液中，用无菌注射器将脾脏或胸腺挤压通过200目的钢丝网，获得单个细胞。用含20%-40%小牛血清的RPMI-1640培养液将细胞配成2x106-4x106/ml的浓度。以每平方厘米2x106-4x106个巨噬细胞的密度将细胞悬液接种到培养皿中。37℃ 5%CO2 培养24小时。用CD14（巨噬细胞特异抗原）抗体做免疫组织化学染色的实验来检验所得巨噬细胞的纯度。