研究目标
以结肠炎诱导和基因突变诱发的结肠癌小鼠模型为分析对象，研究从结肠炎到结肠癌这一过程中动物标本的结肠组织和外周血的分泌蛋白谱变化，分析哪些蛋白质分子在肿瘤发生发展过程中改变显著，寻找可能的肿瘤微环境生物标志物；结合其他课题所得到的结论，采用定量蛋白质的技术开展正常人和结肠癌病患血清蛋白质生物标记物的分析，扩展分泌蛋白质组学在临床医学上的应用。 研究内容
1. 化学诱导型和基因表达型的结肠癌小鼠模型 1.1 AOM及DSS诱导的结肠癌小鼠模型及其处理
将C57小鼠随机分为对照组、AOM组、DSS组和AOM-DSS组四组（15只/组），实验的第一周对AOM组和AOM-DSS组小鼠进行腹腔注射AOM诱发炎症；第二周起给DSS组和AOM-DSS组小鼠饮用DSS溶液直至到十一周实验结束。在实验的第四、八、十一周这三个时期，分别处死各组的5只小鼠，取外周血和炎症/肿瘤组织标本，行组织学大体评分、组织病理评分以及透射电镜观察。
1.2 APCmin转基因小鼠模型及其处理
将APCmin小鼠与其亲本C57小鼠进行配对分组。按照APCmin小鼠的病程进展，分别在其无明显改变阶段（两周）、不典型增生阶段（十周）和腺瘤/癌阶段（二十周）三个时间点，分别处死两组的5只小鼠，取外周血和肿瘤组织标本，行组织学大体评分、组织病理评分以及透射电镜观察。 1.3 小鼠结肠癌模型的癌组织和癌旁组织的分离
将小鼠处死后，取其自盲肠至肛门段肠道，纵向剖开，将内容物清洗干净。在解剖显微镜下进行观察，按照如下标准对病灶进行分期评估。炎症病灶：肠粘膜局部红肿，质软可有良性溃疡形成，粘膜皱襞完整光滑。不典型增生：肠壁变厚，有广泛息肉形成，质软，肠腺窝加深。腺瘤/腺癌：二者均呈乳头状或绒毛状增生，质韧或质硬，正常腺管组织结构消失，少出现恶性溃疡；腺瘤与中早期腺癌在大体病理上很难分清，晚期腺癌可浸润到粘膜肌层或浆膜层。癌旁组织：我们将不典型增生及腺瘤/癌周围2cm内的粘膜上皮定义为癌旁组织。取部分新
鲜病灶组织及癌旁组织进行体外组织培养。余下组织一部分用液氮迅速冷冻储存；另一部分用甲醛固定过夜，采取传统石蜡包埋、切片，用于明确组织病理分期及组织免疫化学（IHC）实验。
1. 小鼠结肠癌癌旁和癌组织的体外培养以及分泌蛋白质组分析 2.1组织分泌蛋白质制备
用RPMI1640培养基对新鲜粘膜上皮组织块进行清洗，用解剖刀将组织切割成为直径2cm，厚1-2mm的小片，称重，取10-15片组织放入细胞培养皿中，37℃、5%CO2条件下进行培养。培养基采用含有左旋谷氨酰胺、青霉素、链霉素的无血清RPMI1640培养基，培养基24小时更换一次并收集，共收集48小时的培养基进行冻干。
2.2 组织分泌蛋白质的亲和富集技术及应用 为了富集组织分泌液中的低丰度蛋白质，针对癌组织可能的分泌蛋白质形式，同时考虑到蛋白质亲和技术的现状，将应用三种亲和技术来富集分泌蛋白质：1）S100蛋白质家族：这是一类广泛报道的分泌蛋白质，根据其家族成员具备Ca2+结合的特点，可采用Ca2+亲和层析法富集S100蛋白质；2）Cathepsin蛋白质家族：这是一类具有蛋白质酶活性的分泌蛋白质，根据其家族的保守肽段序列，制备相对应的单克隆抗体，将抗体固定于Sepharose树脂用于Cathepsin家族成员的富集；3）MMP蛋白质家族：这是一类具有基质蛋白质酶活性的分泌蛋白质，根据TIMP-1结合MMP蛋白质的特点，制备TIMP-1亲和树脂来富集MMP家族蛋白质。 2.3 组织蛋白质组定量分析
我们将采用两种定量方法来比较小鼠结肠癌癌旁和癌组织的分泌蛋白质组。1）SILAC分析：将癌旁组织在无标记氨基酸的条件RPM1640培养基中培养48小时，而癌组织在含有Leu-d3氨基酸的条件RPM1640培养基中培养48小时。提取培养基中的蛋白质，将两个条件下培养的蛋白质等量混合，经胰蛋白酶完全消化和LC-MS/MS质谱鉴定，从质谱图上含有Leu的肽段的Leu-d0/Leu-d3的一对“轻-重”同位素峰强度的比值即可确定癌旁和癌组织的分泌蛋白质。2）iTRAQ分析：将癌旁组织和癌组织在条件RPM1640培养液分别培养48小时。在培养液中收集蛋白质后，采用SDS-聚丙烯酰胺变性蛋白质，胰蛋白酶完全消化蛋白
质。等量的肽段分别用iTRAQ试剂标记，然后采用三重四级杆ESI质谱仪定量测定所标记的肽段，从tag质量和信号强度差异上可计算癌旁和癌组织的分泌蛋白质。
3. 小鼠结肠癌模型的血清蛋白质的MRM分析及免疫检测 复杂的蛋白质混合物中的定量分析一直是蛋白质组分析的困难之一。传统的方法是免疫测定技术，譬如Western Blot或ELISA。从严格定量测定而言，由于抗体的专一性和滴度的差异，基于免疫反应的定量方法只能是半定量技术。近年来，生物质谱技术为蛋白质组定量提供了快速、准确的方法。在本项目中采用MRM方法作为血清生物标志物定量测定的基本技术。MRM是一种基于MS/MS信号的定量技术，它既不需要特殊的化学标记辅助，也能够同时进行绝对和相对定量测定。
3.1 小鼠结肠癌细胞及其相关细胞的分泌蛋白质的综合分析
在第一、二和三课题中，我们开展了小鼠结肠癌细胞与TAM、TAF或上皮细胞的二元、三元的细胞共培养，和共培养体系的差异分泌蛋白质组的测定。从这些工作中我们初步筛选到一些与结肠癌微环境相关的分泌蛋白质。在此基础上，我们将进一步把二元/三元分析的蛋白质组结果综合起来，加以统计分析，确定与结肠癌微环境相关的分泌蛋白质。这些候选蛋白质与组织分泌蛋白质的分析结果相结合就构成了MRM理论分析的靶标蛋白质。 3.2 小鼠血清结肠癌相关蛋白质标志物的MRM理论分析 根据分泌蛋白质的分析结果，我们可望获得若干结肠癌相关的蛋白质的候选物。MRM质谱定量的方法可以同时对多个蛋白质的特征性子离子对进行检测和定量。利用在LC-MS/MS鉴定过程中检测到的质谱搜索结果，分析这些标志候选物同源性，确定并合成每个蛋白质的特征性肽段。采用ProteinPilot3.0和MRMPilot2.0软件，建立这些蛋白质MRM定量分析的MIDAS初始方法。采用三重四级杆质谱仪确定能被MRM-EPI检测的候选母子离子对。去除背景干扰大和容易产生假阳性结果的母子离子对。 3.3 血清蛋白质标志物的MRM测定
稀释小鼠血清，通过Affinity-depletion色谱柱去除血清中高丰度的蛋白质，然后用冷三氯醋酸沉淀蛋白质，并以SDS溶液溶解沉淀蛋白质，SDS-聚丙烯酰
胺变性蛋白质，胰蛋白完全消化蛋白质。所产生的肽段通过反相nano-HPLC分离，直接进入三重四级杆质谱仪。每个蛋白质选择一对母子离子对，质谱仪发现多肽母离子被检测，立即切换至MS/MS扫描模式。采用稳定同位素化学合成法合成所选定的肽段，将这些标准物加入到消化肽段中，以保证获取绝对定量数据。 3.4 血清蛋白质标志物的免疫法测定
针对可能的血清蛋白质标志物，购买或制备抗这些蛋白质的单克隆抗体，每一个蛋白质均需要至少两个以上的高特异性高滴度的单克隆抗体。采用ELISA-ECL技术作为定量测定的基本方法，以重组蛋白质为标准参考。 4. 小鼠结肠癌模型的分泌蛋白质组比较分析 在系统分析小鼠癌组织间液和血清中的分泌蛋白质基础上，我们将比较AOM-DSS和APCmin两种小鼠结肠癌的分泌蛋白质的异同，试图从中勾画出两种动物模型的发病机制异同和可能的共同生物标志物。
5. 小鼠细胞和结肠癌模型的分泌蛋白质组数据的综合生物信息分析
本项目的实验设计的核心思想之一，是以细胞和动物模型的蛋白质组分析为出发点，试图较为完整地解析小鼠结肠癌肿瘤微环境的分泌蛋白质组，同时也开展分泌蛋白质组对几种微环境细胞功能影响的研究。因此，我们在实验中选用了来自C57小鼠的细胞、细胞系和动物模型，从而避免了在实验材料上可能造成的误差。根据我们的设计，本项目从体内和体外实验中可取得2x6个基本数据集：巨噬细胞、TAM、成纤维细胞、TAF、结肠上皮细胞、结肠癌细胞的分泌蛋白质组。我们也将获得2x5个差异蛋白质的数据集：巨噬细胞与TAM、成纤维细胞与TAF、结肠上皮细胞与结肠癌细胞、结肠上皮细胞与TAM、结肠上皮细胞与TAF。此外，我们也会获得小鼠结肠癌组织分泌蛋白质组、小鼠/人的血清蛋白质组等。我们将运用生物信息学方法，整合所有小鼠结肠癌肿瘤微环境的分泌蛋白质相关信息，建立相应的蛋白质组数据库，并综合分析，深入挖掘这些数据所蕴含的病理和应用价值。
6. 结肠癌临床血清的定量蛋白质组分析 6.1 结肠癌临床血清样本的收集和分类 首先，通过比较结肠癌、正常人血清找出可以区分这两组血清的特异性抗原组合；其次，通过比较结肠癌血清与其它肿瘤患者血清和非肿瘤的肠炎疾患检测
的蛋白标志物是否具有结肠癌特异性；最后，研究这些标志物能否区分结肠癌不同亚型。据此，计划收集如下血清样本：结肠癌患者血清，500例、非肿瘤的肠炎疾患患者的血清，150例、肝癌患者血清，150例、乳腺癌患者血清，150例、胃癌患者血清，150例、健康人血清，300例。 6.2 血清中低丰度蛋白质和肽段的富集 我们将采用四种方法来富集血清中低丰度蛋白质：1）抗体亲和色谱去除血清中大约20种高丰度蛋白质，2）在去除高丰度蛋白质的样本中加入糖苷亲和树脂进一步富集血清中低丰度糖蛋白，3）针对血清中可能的蛋白标志物家族的亲和层析富集技术，例如MMP和S100家族等，和4）利用疏水磁珠富集血清中的游离肽段。
6.3 血清中结肠癌相关蛋白质标志物的定量测定 如上所述，人血清蛋白质标志物的定量测定将首先采用MRM为基本技术，同时也用免疫测定法作为补充手段和参照。其中，MRM分析的候选标志物将来自于两个方面：1）小鼠结肠癌模型和细胞的分泌蛋白质组综合分析的结果；2）文献报道可能的肿瘤相关血清蛋白质标志物（不一定是结肠癌相关的）。 6.4 定量血清蛋白质标志物的数据分析 预测模型构建：对于初级阶段的样本，我们将测定的数据分为两部分（比例为1:1），其中一半样本作为构建模型的训练集（training set），另一半作为测试集（testing set）。通过统计分析，找出结肠癌血清和正常血清中具有显著性差异的抗原。将这些抗原作为构建统计模型的候选，带入支持向量机（support vector machine，SVM）统计模型中，并用此模型计算这些抗原的组合对于结肠癌诊断的效果。通过训练样本得到的统计模型，如果回带到训练样本中，其诊断价值往往会过度优化。为了避免这种情况的发生，我们还需要将这个统计模型带入到验证样本中，验证其诊断效果是否与训练样本一致。
模型特异性验证：预测模型的构建阶段，我们使用的样本仅仅包括结肠癌样本和正常对照，因此，这个分析结果仅仅能说明是否可以区分结肠癌和正常血清。如果要证明这个抗原组合（即构建好的统计模型）是否具有结肠癌特异性，我们还必须将在结肠癌中诊断的结果与其它血清（肠炎疾患和其它肿瘤血清）诊断的